唾液淀粉酶的性质和活力测定·

唾液淀粉酶的性质和活力测定

一．实验目的

（一）1通过唾液淀粉酶性质的测定，了解酶的专一性和多种因素对酶粗反应的影响，pH，底物浓度，温度，激活剂，抑制剂等2学习酶活力，酶活力单位，比活力的测定，加深对概念的理解；

3学会用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量，学会用3,5-二硝基水杨酸测定还原糖的含量，熟练操作分光光度计。

二．实验试剂和器材

器材：可见光分光光度计，试管，移液管，恒温水浴锅，pH试纸，1000ml容量瓶和100ml的容量瓶各一只；

药品：可溶性淀粉，考马斯亮蓝试剂G-250，3,5-二硝基水杨酸，NaoH,HCL，标准牛血清白蛋白溶液，醋酸，醋酸钠，蒸馏水，95%乙醇，85%磷,；0.15molNaCL/ml，0.15mol/L硫酸铜溶液，碘化钾–碘溶液：将碘化钾20克和碘10克溶解在100ml水中，使用前稀释10倍。

注：（1）考马斯亮蓝G-250试剂：考马斯亮蓝试剂G-250100mg 溶于95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，加水稀释至1000ml，过滤即可。

（2）标准牛血清白蛋白溶液：结晶牛血清白蛋白用凯式定氮法测蛋白含量，根据其纯度用0.15mol/L Nacl配置成0.1mg/L的蛋白液；

（3）配置0.01%g/ml,0.1%g/ml,，0.5%g/ml,1%g/ml,2%g/ml,3%g/ml 的的溶性淀粉溶液;

(4)配置一系列pH2的缓冲溶液

0.2Mol/L磷酸氢二钠溶液为28.40g/L,Mr=141.98,称取2.84g溶于100ml的水中

5配置0.15mol/L的NaCL溶液和0.15mol/L硫酸铜溶液

三．实验步骤

（一）

1 pH的对酶的影响

1）葡萄糖标准曲线的制定

准确称取100mgAR纯的葡萄糖，溶于蒸馏水中，定容于100ml的容量瓶中，配成1.0mg/L的溶液，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml的蒸馏水于550nm处测吸光度；

2）取一试管加入2ml淀粉并滴加两滴碘液，加入适量的酶，记录溶液颜色退去的时间，作为接下来各步反应的反应时间t；

3）取十二只试管并编号分别加入2ml缓冲液

加入2ml，0.1%淀粉，再加入适量的酶，反应t后加入3,5-二硝基水杨酸1.5毫升，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml 的蒸馏水于550nm处测吸光度；

4）由pH值和吸光度做曲线，找出最适pH值

2温度对酶活性的影响

1）取十只试管并编号，分别加入2ml，0.1%淀粉液和相同量的酶同时置于0---100，温度间隔10度，反应t后加入3,5-二硝基水杨酸1.5毫升，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml的蒸馏水于550nm处测吸光度；

2）由吸光度和温度做曲线，找出最适温度值

3底物浓度对酶活性的影响

1）取十只试管并编号并编号1-10，由1,2步知最适温度和最适PH调节温度PH值至最合适，然后分别加入0.01%g/ml,0.1%g/ml,，0.5%g/ml,1%g/ml,2%g/ml,3%g/ml淀粉溶液2ml并加入等量的酶，反应t后加入3,5-二硝基水杨酸1.5毫升，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml的蒸馏水于550nm处测吸光度；

2）做吸光度和底物浓度的曲线图，找出最适底物浓度；

4激活剂和抑制剂对酶活性的影响

取三试管并编号123，分别加入2ml0.1%淀粉溶液，加入最适pH值

的缓冲液并在最适温度水浴中保温5min

后加入1m稀释的唾液淀粉酶，T时间加入3,5-二硝基水杨酸1.5毫升，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml的蒸馏水于550nm处测吸光度；

比较吸光度的大小；

（二）酶活力和比活力的测定

1)蛋白质标准曲线的制作

取十二只试管平行操作

2）用标准蛋白质质量为横坐标，吸光度为纵坐标做标准曲线

3)定义：酶活力单位：每分钟生成1mg葡萄糖所需的酶量

4）取一只试管加入一定的酶液（用移液器）加入考马斯亮蓝G-250试剂1.00ml，并和0号管对比，加0.15mol/LnaCL是液面齐平，混匀，1h以内已0号试管为空白对照，在595nm处比色测吸光度；

5）根据蛋白质标准曲线求出酶蛋白含量；

6）调节ph加入最适淀粉量，t时间后加入3,5-二硝基水杨酸1.5毫升，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml的蒸馏水于550nm处测吸光度；

7）由葡萄糖标准曲线求出此时的葡萄糖含量；

8）计算酶活力和酶比活力；