菠菜叶绿体的分离及荧光观察

菠菜叶绿体的分离及荧光观察
实验目的：
1.学习荧光显微镜的基本原理。

2.普通光镜下观察植物叶片中的叶绿体形态特征，并利用荧光显微镜观察叶绿
体的自发荧光。

3.吖啶橙染色后观察叶绿体及核碎片中的DNA。

实验原理：
荧光显微镜的激发滤片能使标本产生的特定波长的光通过，阻止对激发荧光无关的光。

阻挡滤片可以阻挡掉没有别标本吸收的激发光，有选择地透过荧光。

有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。

有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。

将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。

一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。

在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。

依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。

沉降顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体溶酶体、内质网与高尔基体、核蛋白体。

叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4 mol ／L蔗糖溶液)中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。

将匀浆液在1000 r ／min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。

然后，在3000 r／min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。

分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。

实验步骤：
1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml0.35mol
／L NaCI溶液中，装入组织捣碎机。

2.利用组织捣碎机低速(5000r／min)匀浆3~5min。

3.将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。

4.取滤液4ml在1000r／min下离心2min。

弃去沉淀。

5.将上清液在3000r／min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部
分细胞核)。

6.将沉淀用0.35mol／L NaCl溶液悬浮。

7.取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观
察：①在普通光镜下观察；②在荧光显微镜下观察；③取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0．01％吖啶橙荧光染料，在荧光显微镜下观察。

8.在叶片反面沿叶脉撕一片透明薄膜，滴一滴生理盐水，观察叶片表面的气孔。

实验结果：
图一叶片表面的气孔从右侧的图片中可以看出，保卫细胞呈半月形，内有叶绿体（箭头所指）。

图二菜叶表面的圆形颗粒在实验中发现菠菜的表面有很多白色的小点，很像虫卵，但在显微镜下发现圆形颗粒通过一根细管（箭头所示）与叶脉相连。

（此照片不是很清晰，但在显微镜下可以看到很明显的细管）由此推测，叶片表面的白点很可能是虫卵，且可通过与叶脉相连的细管吸取营养。

图三 叶绿体在普通光镜与荧光显微镜下的图像 左图中绿色的圆形或椭圆形颗粒为叶绿体；右图中火红色的荧光是由叶绿体发出的。

图四
吖啶橙染色后图片 图中橘红色的颗粒为叶绿体的激发荧光，黄色颗粒为核DNA 的激发荧光，背景为绿色说明此载玻片中含有很多杂质，可以受激发出荧光。

实验总结：
通过本次实验观察到了植物叶片中叶绿体的形态、大小及荧光特性。

学习了荧光显微镜的基本原理。

实验中发现部分细胞中有一部分叶绿体可自由转动，而其他叶绿体固定不动，这可能是由于处于不同部位的叶绿体受光的照射强度不同，而照射强度大的叶绿体为了避免损伤会自发的地向照射强度小的方向转移。

但实验中采用的底光源使视野中的光强度基本是一致的，所以叶绿体的转动也可能是由于胞质环流造成的。