人类外周血染色体标本制备以及G带标本制备

实验报告

课程名称：分子医学实验指导老师：_ _ ________成绩：__________________

实验名称：人类外周血染色体标本制备以及G带标本制备组别：___同组学生姓名：

一、实验原理

1.人类外周血染色体标本制备

在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。

在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。在细胞培养过程中加入植物血凝素（phytohaemagglutinin, PHA），可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。

本方法在遗传病的诊断等方面广泛应用。

2.G带标本标本制备

将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行预处理，胰酶可以从染色体上抽取特定的疏水蛋白

然后用Giemsa染色。A-T相对丰富的区域染为深带，G-C相对丰富的区域染为浅带

Giemsa染料是由天青和伊红分子，染色首先取决于二个天青分子同DNA结合，在此基础上它们结合一个伊红分子，其次取决于一个有助于染料沉淀物积累的疏水环境。

二、实验步骤

1. 采血、接种

2. 细胞培养（lymphocytes culture）

RPMI1640培养液(含PHA)，37℃±0.5℃恒温中培养72小时。

3. 秋水仙素(colchicine)处理

在终止培养前２-３小时，加入秋水仙素。

4. 离心（centrifugation）

以1000rpm离心10分钟，弃上清，留沉淀，并用吸管打匀。

5. 低渗处理（hypotonic treatment）

加８毫升预温(37℃)的0.075M KCl低渗液（hypotonic solution），用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，37℃水浴箱静止25－30分钟。

6. 预固定（pre-fixation）

低渗后，加新配的固定剂（甲醇︰冰醋酸=3︰1）１毫升，用滴管打匀。

7. 再离心

1000rpm离心10分钟，弃上清液，留沉淀。

8. 固定(fixation)

加入固定液（甲醇︰冰醋酸= 3︰1）至5ml，将沉淀打匀，固定15分钟。

9. 再离心

1000rpm离心10分钟，弃上清液，留沉淀。

10. 再固定：

加入固定液（甲醇︰冰醋酸= 1︰3）至5ml，固定15分钟。

11. 再离心

1000转/分离心10分钟，弃去上清液，留沉淀。

12. 再固定

加入固定液（甲醇︰冰醋酸= 1︰1）至5ml打匀，固定15分钟。

13. 制片

固定后，1000rpm离心10分钟，留下0.2ml沉淀物，吸取细胞悬液在冰水浸泡过的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在洒精灯焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥（air drying）。切记不要离火太近，以免烤焦玻拨片，影响后面的实验。

14.G带标本制备

①先将胰酶液水浴加热到37℃

②将染色体标本浸入胰酶液中，作用时间几秒到几十秒不等，依样本存放时间长短而定。（标本需预先经60~70℃烤2小时，或37℃恒温老化5~7天。标本太新鲜，染色体有些毛）

③取出玻片标本，在生理盐水中过一下，再经过蒸馏水洗

④Giemsa 染色8分钟

⑤自来水洗、晾干

15.镜检

三、实验结果

图中，染色体散落在一处,且形态清楚。在油镜下，G带清晰，染色体数目为46条。由我们的实验可得到经验，用胰酶处理时30,45,60s时效果最佳。

四、讨论

①注意事项

1、采血接种培养时，注意加入适量的肝素。

2、培养基中不含L-谷氨酰胺，则溶解有RPMI1640培养基的液体可先用浓盐酸调pH值等于4，然后高压灭菌（注意121℃，15磅，灭菌15分钟）。冷却后，再加入L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、PHA、灭活小牛血清和双抗。

3、培养过程中，如发现血样凝集可轻轻震荡，使凝集块散开，继续培养。

4、温度和培养液的酸碱度十分重要。人的外周血中淋巴细胞培养最适温度为37℃±0.5℃，温度过高过低都将影响细胞的生长，但细胞对低温比对高温耐受力强；若是中途停电，可相应延长培养时间。培养液的最适pH7.2-7.4。pH偏酸，细胞发育不良，偏碱细胞会出现轻度固缩。

5、PHA的质量和浓度是培养成败的关键问题。PHA如果保存时间太长，效价会降低，应在培养基中多加一些。

6、接种的血样愈新鲜愈好，最好在24小时内培养。如果不能立刻培养，应置于4℃冰箱，保存时间过久会影响细胞活力。

7、最好使用水平式离心机，离心速度不易过高，否则沉降在管底的细胞团不易打散；反之，离心速度太低，细胞会丢失。

8、培养失败的可能原因：

（1）配制培养基溶液的二或三蒸水不合要求。

（2）PHA和培养基存放时间过长。

（3）无菌操作不符合要求，发生细菌污染。

（4）培养瓶等器材洗涤不合要求。

9、标本质量不佳的原因：

（1）秋水仙素处理不当。

（2）低渗处理不当，低渗时间的掌握与气温有关。

（3）离心速度不合适。

（4）固定不充分：如固定液不新鲜，染色体形象模糊，呈毛刷状，染色体周围有胞浆背景。因此，固定液纯度要高，临用时新鲜配制。

10、带效果的好坏，主要取决于染色体的标本质量。标本染色体要长，染色体分散合适，背景无胞浆，标本未老化即保存时间过长。

11、要注意胰酶处理的温度和实践，稳定显带的条件，才能保证显带效果。

12、磷酸缓冲液的PH不要过碱，偏酸为宜，否则着色不鲜明。

②思考题

1、将染色体浸入胰酶液中需要注意什么？

在这个过程，必须要有梯度的作用时间。整个胰酶作用的时间与样本存放时间有关。在酒精灯上过火是时间过长，相应的胰酶作用也要加长。因此，为了确定适宜的胰酶作用时间，我们必须采取梯度的作用时间，来帮助我们确定。所以，第一长玻璃片往往是预实验。

胰酶作用时间过长，染色体太过分散甚至观察不到染色体，使镜检效果不好。胰酶作用时间过短，染色体未很好地分离，难以观察。

2.镜检中的染色体是怎样的？

低倍镜下看到中期分裂相，进而转至高倍镜及油镜下观察，课件23对染色体较为饱满，分布均匀，着色