基因工程学第四章_基因克隆的质粒载体
基因工程载体质粒
基因工程载体质粒是用于携带、传递和表达外源基因的工具。它在生物学研 究和应用领域起到至关重要的作用。
基因工程载体质粒的定义、作 用和意义
基因工程载体质粒是一种双链环状DNA分子，能够自主复制，并能将外源基 因稳定地引入宿主细胞中。它为基因工程研究和应用提供了可靠的平台。
常见的基因工程载体质粒类型
质粒
小型、可以独立复制的环状 DNA分子。
噬菌体
包裹载体质粒的蛋白外壳。
人工染色体
可容纳更大量级的基因片段的 载体。
基因工程载体质粒的结构和特点
1 起源
包括起始位点、选择标记和调节元件。
2 多样性
3 稳定性
可以按需求设计，适应不同的实验目的。
能够在宿主细胞中稳定传递和复制。
基因工程载体质粒的构建方法和技术
1
互补连接
将多个DNA片段连接起来形成完整质粒。
PCR扩增
2
通过PCR技术扩增需要的DNA片段并插入质
粒。
3
电泳分离
利用电泳将DNA片段分离出来，进行后续的 连接和转化。
应用基因工程载体质粒进行基 因转化的研究进展
通过基因工程载体质粒进行基因转化已经在植物、动物和微生物等领域取得 了重要进展，为基因研究和应用提供了广阔的空间。
随着基因工程技术的广泛应用，合理使用和管理 基因工程载体质粒成为重要课题，以确保安全和 可持续发展。
基因工程载体质粒在农业、医学等领域的应用 案例
农业
医学
利用质粒载体转导抗虫、抗病等功
通过质粒载体传递治疗基因，用于
能基因，提高作物产量和抗逆能力。 基因治疗和药物研发。
生物技术
利用质粒载体进行基因克隆、基因 表达和蛋白质表达等研究。
基因工程载体
二、噬菌体载体 （一）、λ噬菌体载体
1、λ噬菌体载体的特征
λ噬菌体颗粒中DNA为线状双链DNA分子，全长48502bp， 两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链（粘端），称 为cos位点。λ 噬菌体有61个基因，其中有1/3的区域是其 裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中 插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ 噬菌体 可作为基因载体的依据 。
第一节
微生物基因工程载体
克隆载体（cloning vecto载体（expression vector）：能使目的基因在宿 主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子， 更要有强启动子； 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细 胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
四、酵母菌载体
多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为 2μ 质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主 复制功能区域（ARS片段）。 根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、 附加型和稳定型等类型。
共同的特点：
①含有E.coli质粒的复制起始序列，这样在外源基因转到酵 母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
重组体的筛选
. .. . . . . .
涂布有Tet的培养基
.. .. . .
涂布有Amp的培养基
3、pUC系列质粒载体
（1）特点 具有更小的分子 量（2686bp）和 更高的拷贝数。 具有多克隆位点
可用组化方法鉴别：
含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因 （LacZ′），它编码β -半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸 ， 可以和β -半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补， 即α —互补 ，恢复分解乳糖的能力。 X-gal也是β -半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴 氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无β -半乳糖苷酶时， X-gal不被分解，菌落呈白色。 当外源基因插入到pUC质 粒的LacZ′基因内部，则LacZ′基因受到破坏，便不能 再和缺陷型受体菌中生成有活性的β -半乳糖苷酶，因此， 菌落呈白色。 反之，非重组体为蓝色菌落。 可通过插入失活法进行筛选
基因工程第四章载体
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
第四章 基因工程的质粒载体
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
(1)高拷贝数的质粒载体 - 西北师范大学
西北师范大学 精品课程 武国凡
基因工程
第四章 基因工程质粒载体 返回第四章
高拷贝数：自身基因功能控制，与寄主无关
低拷贝数：自身与寄主共同控制，与寄主染色体同步复制
失控：一些低拷贝数的质粒，其复制控制是温度敏感型的。 例如 POU71质粒，在低于 37C下培养，每条染色体平均只有一个拷贝， 但当温度上升到42 C时，其拷贝数可增加到1000个以上。在这种高温环 境下，细胞的生长及蛋白质的合成可按正常的速率持续2～3小时。这期 间编码在质粒载体上的基因产物便超过了常量。最后，细胞生长受到了
基因工程
第四章 基因工程质粒载体 返回第四章
4.2.2 质粒拷贝数控制
常用的定义是指，生长在标准的培养基条件下，每个细菌细 胞中所含有的质粒DNA分子的数目. •10~100个拷贝，称为高拷贝数质粒，松弛型 •1~4个拷贝，为低拷贝数质粒，严紧型 •质粒最多可以占到细菌总DNA的0.1％ ~ 5％。
第四章 基因工程质粒载体 返回第四章
4.4.3 质粒载体的选择记号
素抗性等多种。
包括有新陈代谢特性、对大肠杆菌素EI的免疫性，以及抗菌
绝大多数的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号，而且主要集 中在四环素抗性、氨节青霉素抗性、链霉素抗性、卡那霉素 抗性等少数几种抗菌素抗性记号上。 一方面是由于许多质粒本身就是带有抗菌素抗性基因的抗药
西北师范大学 精品课程 武国凡
基因工程
第四章 基因工程质粒载体 返回第四章
4.1.3 质粒的转移
4.1.3.1 按结合方式分类类型：结合型和非结合型 雌一雄细胞配对过程为细菌的接合作用。
分类 主要基因
按抗性记 号分类 Col质粒 R质粒 F质粒 Col质粒 R质粒 Col质粒
4第四章 基因克隆的载体-1质粒
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
第4章 载体的选择与构建
大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点，它们在质粒 自主转移过程中起着重要作用。
tra 基因：大多数 tra 基因的产物与性菌毛的形成 (F 、 RP4 和 pKMl01 都 编码一根性菌毛 )、杂交对的形成有关；有些 tra基因编码作用于 oriT位 点的内切酶，使质粒中的一条 DNA链产生切口，从而开始转移；有些 tra基因则与质粒转移调控等有关。
pMB1, colE1 replicon 修饰的pMB1 replicon pSC101 pUB110 pE194 replicon
拷贝数15～20
宿主范围小：肠细菌
拷贝数500～700 宿主范围小：肠细菌（pUC系列) 拷贝数5 50 5 宿主范围广 多种革兰氏阴性菌 广 多种革兰氏阳性菌 广 多种革兰氏阳性菌
pSC101 replicon
1.4 质粒的不稳定性 ★
分离不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNΑ
拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体；
结构不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒 DNA的重排与缺失
质粒的分配方式： 主动分配 平均分配:每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝 配对位点分配:只有一对质粒呈主动分配，其余的是随机分配。 主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳 定性 随机分配 分配不稳定，部分子细胞没有质粒，并在生长过程中具有优势而逐渐使 含质粒细胞比例越来越少
RBS，融合tag） 基因敲除质粒（筛选系统，目的基因的 同源片段） 辅助性质粒（例如提供位点特异性重组酶）
1.3 质粒的复制 ★
1.3.1 复制子(replicon) 包括复制起点(ori)、复制控制元件、复制蛋白编码基因的遗 传单元
基因工程-第四章
（4） 插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
抗菌素抗性
外源DNA 无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体（Direct selection vectors）
直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转化 菌细胞才能在选择培养基上生长。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。
各类载体
pBR322 外源基因Pst I
Tet中存活 但在Amp中死亡
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
pBR322 外源基因Pst I
Tet中存活 但在Amp中死亡
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
3. pUC系列
•University of California 的 J. Messing 和 J. Vieria 于1978年，在pBR322 的基础上改造而成，如 pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、 pUC19。 • 元件来源
• 质粒空间构型与电泳速率
分子量相同的，scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最 慢。
OC L
SC
质粒的生物学基本特性
1.自主复制性
• 质粒复制子是质粒 DNA 中能自主复制并维持正常拷贝数的 一段最小的核酸序列单位。
• 两部分组成：复制起始区（ori）及其相关的调控元件。 • 质粒能利用寄主细胞的 DNA 复制系统进行自主复制。 • 质粒 DNA 上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系
必要的条件能力。
理想载体至少必备的条件
① 能在宿主细胞中自主复制 ②容易进入宿主细胞 ③ 容易插入外来核酸片段 ④ 容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作 ⑤ 具有合适的筛选标记 ⑥ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程是一种用于改变和改造生物体遗传基因的技术，它是利用分子生物学技术提高生物性状的一种新技术。
在基因工程中，需要使用一种材料将外源基因投入细胞中，这种材料就是载体。
基因工程中常用的载体有以下三种：
1. 质粒载体. 质粒载体是一种比较常见的基因工程载体，具有较强的稳定性，它是一种质粒DNA，也称为质粒DNA，不是单链DNA，它是由细菌质粒的DNA结合其它分子，形成质粒DNA的结构，具有可复制性能，可以在细菌或动物细胞中复制，具有较强的稳定性。
2. 杆状病毒载体. 杆状病毒载体是一种比较常见的基因工程载体，它由病毒的全基因组和其它分子形成，用来转移外源基因到细胞中，可以把外源基因转移到细胞核或任何其它的地方，可以实现基因工程的目的。
3. 化合物载体. 化合物载体是一种新型的载体，它是由多种不同的分子组成的，可以将外源基因转移到细胞核或其它位置，并且可以把这些基因在细胞中表达出来，从而实现基因工程的目的。
基因工程简答题总结
基因工程原理复习题思考题5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。
同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。
同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。
分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。
不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。
）6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。
不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。
7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。
（传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。
2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。
这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。
3、足够多的载体和插入片段是最重要的。
4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修饰过的T7 DNA聚合酶6）逆转录酶7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
第4章 基因工程载体
的转化细胞，细胞内含有的DNA分子一定不是重组子。一种
理想的质粒克隆载体应该具有两种选择标记基因，并且在选 择标记基因内有合适的克隆位点。常用的选择标记基因主要 是抗生素的抗性基因[如四环素抗性（Tetr或Tcr）、氨苄青霉 素抗性（Ampr或Apr）、卡那霉素抗性（Kanr或Kmr）、氯 霉素抗性（Cmlr或Cmr）、链霉素抗性（Strr或Smr）等]和β半乳糖甘酶基因。
（5）基因工程所应用的质粒通常为非传递性的松弛型质粒，
安全可控，不至于对操作者和环境带来不必要的危害。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
三、常用的质粒载体
1. pBR322质粒载体 1977年，F. Bolivar和R. L. Rodriguez 构建了一个典型的用
于基因克隆的通用质粒载体—pBR322质粒载体。目前使用
白质分子，内部的核酸一般是双链线性DNA分子，也有的是
双链环形DNA、单链线性DNA、单链环形DNA以及单链 RNA等多种形式。不同种噬菌体之间，其核酸的分子量相差 可达上百倍。而且有些噬菌体的DNA碱基并不是标准的A、T、 C、G四种碱基组成。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
溶源性噬菌体的生命周期（引自吴乃虎，1998）
导致Ampr基因的失活。这种因DNA插入而导致基因失活的现
象，称之为插入失活效应。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
大肠杆菌pBR322质粒载体的结构图
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
pUC质粒载体
1987年，美国加利福尼亚大学（University of California）的 科学家J. Messing 和J. Viria在pBR322质粒框架基础上构建
大学《基因工程学》教学大纲
《基因工程学》课程教学大纲（Genetic Engineering）一、课程说明课程编码：02200200课程总学时（理论总学时/实践总学时）：48（48/0）周学时（理论学时/实践学时）：4（4/0）学分：31．课程性质：专业必修课。
2．适用专业与学时分配：适用生物技术专业。
教学内容与学时分配3．课程教学目的与要求：本课程的授课对象是生物技术专业的本科生。
课程简介：《基因工程》是生物技术专业的专业必修课程。
其以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段而建立起来的一门技术学科。
基因工程兴起于20世纪70年代初，它的问世带动了生物技术的兴起和发展，是现代生物技术的核心内容。
基因工程课程的主要内容包括基因的分离、基因的克隆、基因的表达、植物基因工程、动物基因工程、药物基因工程和基因治疗等。
它是生命科学学院生物技术专业本科生的主干专业课程之一，它是生物工程（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程）中最重要的课程，其它三大工程是建立在基因工程基础之上的，同时也为生物技术制药等后继学科奠定了重要的理论基础。
课程目标：设置本课程是为了让生物技术专业的学生理解和掌握基因工程的技术原理，通过本课程学习，掌握基因操作的工具酶，基因克隆常用载体，目的基因的分离与合成，重组体的构建，重组体向宿主细胞的导入，重组体克隆的筛选与鉴定以及克隆基因的表达，同时了解基因工程在生物学领域中的应用与发展前景。
对学生达到毕业要求贡献如下：1）了解基因工程学的历史、发展和前沿知识。
2）掌握基因工程学的基础理论、基本知识和基本技能；教学要求：学完基因工程学后，学生将具备以下能力：1）具有良好的自学能力；2）综合运用所掌握的基因工程学理论知识和技能、从事生物科学及其相关领域科学研究的能力。
4．本门课程与其它课程关系：先修课程为生物化学、微生物学、分子生物学、细胞学等，具备基础理论知识及实验能力是基因工程学课程的基础。
简述基因克隆载体的主要类型
简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。
常用于基因工程中，将特定基因序列克隆到载体DNA上，进而进行转化和表达。
根据不同的功能和应用，基因克隆载体可以分为多种类型，以下是主要的几种：
1. 质粒（Plasmid）：质粒是最常用的基因克隆载体之一，通常起源于细菌，具有自主复制的能力，易于操作和扩增。
质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。
2. 病毒载体（Viral Vector）：病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体，具有高度的转染效率和生物安全性。
病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）：人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体，通常具有高度的稳定性和扩增性能。
人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。
4. 原核表达载体（Prokaryotic Expression Vector）：原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。
原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点，被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
基因工程的载体和受体情况讲解
（2）质粒的不相容性（incompatibility）
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质
（3）质粒的可转移性
据此，革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： ✓接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F质粒。 ✓非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R质粒的一些成员。
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质 粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定。
R因子（resistance factor）
✓最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现 还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和 Staphylococcus中。
✓R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子 （resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（rdeterminant）。RTF为分子量约为11×106 Dalton，控制质粒拷 贝数及复制。抗性决定因子大小不固定，从几百万到100×106 Dalton以上，其上带有抗生素的抗性基因。
基因工程的载体和受 体情况讲解
一、用于基因克隆的载体
1.载体的概念
（1）携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 （2）能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞， 具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩 增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。 （3）实质：用来携带目的基因片段进入受体细胞。
三四章分子克隆载体---题目_完_
第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors）一、名词解析二、填空题1.基因工程中有三种主要类型的载体、和。
2.就克隆一个基因来说，最简单的质粒载体也必须包括三个部分和、。
另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子质量。
3.如果两个质粒不能稳定的存在已同一个宿主细胞中，则属于群，这是因为他们的所致。
4.pBR 322是一种改造型质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来源于，它的氨苄青霉素抗性基因来源于。
5.Puc18质粒是目前使用较为广泛的载体。
pUC系列的载体是通过和两种质粒改造而来。
它的复制子来源于，Amp抗性基因则是来源于。
6.当λ噬菌体DNA进入宿主细胞以后是靠宿主细胞的和形成封闭的环状的DNA分子的。
7.λ噬菌体是感染大肠杆菌的噬菌体。
8.α-互补是指 lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的阴性的突变体之间实现互补。
9.溶源化的频率和与有关。
10.噬菌体DNA通过其上唯一的整合位点与宿主染色体DNA上的唯一整合位点发生重组，从而整合到染色体中。
11.通过分析大量缺陷型λ噬菌体的 DNA ，发现 J 基因与 Cro 基因之间的 DNA 被或替换后，不影响λ噬菌体裂解生长。
12.对野生型大肠杆菌来说，向溶源和裂解方向的转变是由和决定的。
13.代表性λ噬菌体载体有和14.粘粒的组成包括________，________，________。
15.柯斯质粒(Cosmid)载体：一种由________和_______cos尾巴构建的复合载体。
16.pcos1 EMBL 是设计用于筛选体内重组的重组粘粒文库，通过同源重组过程达到筛选目标克隆的目的。
该载体的复制起点来源于__________质粒，含_________和_________抗性基因。
17.酵母人工染色体由酵母染色体的__________、__________和__________等功能性DNA序列组成。
基因工程的四大技术
基因工程的四大技术
基因工程是一种通过改变生物体的基因来改变其外部表现的技术，它主要包括了四大技术：基因克隆、质粒载体构建、DNA测序和基因编辑。
基因克隆是指将特定的DNA片段从一个生物体中提取出来，然后将其复制到其他生物体中的过程。
这种技术早期是一种繁琐的手工操作，需要牛仔式的实验技能，并且存在着一定的风险。
随着现代技术的进步，基因克隆已经变得更加可靠和高效。
现在，使用PCR 技术和DNA修饰酶等工具可以快速且准确地进行基因克隆。
质粒载体构建是指将特定的DNA片段克隆到一个称为质粒的小环状DNA片段上。
质粒通常存在于细菌中，是细菌用来存储和传递基因的工具。
构建质粒载体需要将目标DNA片段连接到一个特定的质粒DNA片段上，然后将它转化到宿主细胞中。
质粒载体构建可以被用来生产大量蛋白质、药物和其他化合物。
DNA测序是指将 DNA 的顺序进行分析的过程。
这个技术可以让科学家更好地理解和操纵基因。
对于广泛的应用领域，如医学、环境和农业，DNA测序已成为关键的技术。
现代DNA 测序可以通过自动高通量技术，产生数以百万计的 DNA 片段的快速测序结果。
基因编辑是指通过分子生物学技术直接更改一段 DNA 序列的过程。
这种技术可以让科学家更好地理解基因，并且能够使目标细胞中的基因进行针对性的修改。
基因编辑是作为理解基因和生物活动的研究工具，以及改善人类健康、植物和动物耐逆性等实际应用的工具来使用的。
总之，四大基因工程技术的发展，使得科学家对于基因的理解逐步深入和进一步，也促进了科技和生产效率的提高，为我们的社会和未来奠定了更加坚实的基础。
第四章克隆载体的特征及类型
内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。 5. 能够导入寄主细胞，具备转化的功能。 6. 操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质
粒载体。
质粒人工构建的目的
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点 少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必 须对之进行改造构建： （1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择 （2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组 （3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量 （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件
质粒的构建
质粒
天然存在的两种质粒 colE1宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛型复制20-
30/cell
pSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨型复制5/cell ，标记基因为Tcr
理想的质粒载体应具备的条件
1. 分子量较小。 2. 松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。 3. 具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有
黏性末端
cos
DNA合成控制基因
阻遏基因 早期控制基因
l - DNA
阻遏基因
重组基因
删除与整合基因
COS
3’
5’ TCCAGCGGCGGGG
头部合成基因
尾部合成基因
CCCGCCGCTGGA 5’
3’
COS
噬菌体或病毒DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体DNA
l 噬菌体生物学特性： 感染周期
E.coli
裂解
优点： 分子量小：4363bp, 容易纯化。 含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而 且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，
第四章 基因克隆的质粒载体
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（ SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2021/8/4
2021/8/4
2021/8/4
碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
2021/8/4
2021/8/4
8.质粒ＤＮＡ的分离与纯化
(1)氯化铯密度梯度离心法 (2)碱变性法 (3)微量碱变性法
2021/8/4
氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子
量的细菌染色体易断裂成线性片段，而质 粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的 状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链 的碱基中，导致链的解旋；而且形成的 EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会 越低。
线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而 形成。称L构型。
2021/8/4
什么是超螺旋(superhelix 或supercoil) ？ DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺
旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态， DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构 的一个重要特征。
迁移作用(mobiligation): 由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.
2021/8/4
2021/8/4
从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。 因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障 的潜在危险.
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 至少有一个复制起点，因而至少可在 Pvu I
一种生物体中自主复制。
Pst I
• 至少应有一个遗传标记基因，以指示
Apr
Tcr
pBR322
BamH I Sal I
载体或重组DNA分子是否进入宿主细
4363 bp
胞。 • 克隆载体必须是安全的。
ROI ROP
Bal I
Origin of Replication Hind II
本 节 内 容 结 束 4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达 。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内 才可复制等等。
功能 克隆载体:
克隆一个本基节因内或容D结NA束片断 表达载体:
用于一个基因的蛋白表达 整合载体:
第一节 质粒的一般特性 一、质粒DNA
1、概念 质粒是细菌细胞内携带的 染色体外的DNA分子，是 共价闭合的环状DNA分子 （covalent closed circular， DNA cccDNA) ， 大 小 在 1~200kb，能独立进行复 制。
‹# ›
• 质粒借居于宿主细胞内。 • 质粒靠宿主细胞才能完成自己的复制，而质粒对宿主细胞的生存不
‹# ›
载体的功能
• 运送外源基因高效转入受体细胞 • 为外源基因提供复制能力或整合能力 • 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
‹# ›
载体应具备的条件
• 在克隆载体DNA分子合适的位置有一
至多个克隆位点，供外源DNA片段组 入克隆载体DNA分子。
EcoR I
Cla I
Pst I
Hind III
环状
35- 45kb
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
PAC (P1-derived Artificial chromosome)
YAC (Yeast Artificial chromosome )
MAC (Mammalian Artificial Chromosome)
把一个基因插入到染色体组中
来源： 质粒载体 噬本菌节体内载容体结束 柯斯质粒载体 真核细胞克隆载体
载体的种类和特征
质粒 λ噬菌体 丝状噬菌体及噬菌粒
粘粒载体
受体细胞
结构
插入片断
E. coli
环状
〈 8kb
E. coli
线状
9 - 24kb
E. coli
环状
〈 10 kb
本节内容结束 E. coli
基因克隆的质粒载体
载体
载体（vector）是由在细胞中能够自 主复制的核酸分子构成的一种遗传成分， 可与其它的核酸分子片段连接，并在一 定条件下进行复制。
‹# ›
基因克隆载体
• 源生物体内特定基因在外源生物细胞体内进行表达，首先需要 将基因输送到目的生物细胞体内。能将外源基因送入细胞的工 具就是载体。
• 基因克隆载体(核酸克隆载体)：通过不同途径能将承载的外源核 酸片段(基因)带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。
‹# ›
载体的功能及特征
一、发展概况 1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒 的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al) 2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度）， 建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC 系列载体。 3. 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工 程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含 T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探 针型载体。
是必需的。 • 质粒不是单纯的寄生，所携带的遗传信息能赋予细菌特定的遗传性
状。
‹# ›
质粒游离于染色体以外，在一定条件下可以整合到 染色体上，随着寄主的复制而复制，遗传至后代
‹# ›
2、质粒的存在形式：体内呈共价闭合 环状 ① 超螺旋的SC构型 （ccc DNA） ② 松弛开环的OC型 （oc DNA） ③ 松弛线性的L构型（L DNA）
促旋酶 形成 ccc DNA 拓扑异构酶Ⅰ 解旋
‹# ›
本节内容结束
3、分子量 最小的质粒仅能编码2～3种中等大小的蛋白质，分子量约106dal 最大的可达108dal 4、基因克隆用的质粒载体必需具备： 复制基因 选择性标记 克隆位点
‹# ›
二、质粒DNA编码的表型
• 质粒DNA占染色体组的1～3％，编码i 酵母细胞 哺乳类细胞
病毒载体
动物细胞
穿梭载体
动物细胞 和细菌
环状 环状 线性染色体
线性染色体 环状 环状
≈300 kb 100 - 2000 kb 100 - 2000 kb
〉 1000 kb
举例 pUC18/19 , T-载体
pGEM- 3z等 EMBL系列，λgt系列
‹# ›
3、降解质粒 许多环境污染物的降解途径由质粒基因编码，降解基因组成几个操 纵子，操纵子的表达受调节基因控制。 目前，已经测定全序列并注释基因的降解质粒有10余种，如尼龙寡 聚体降解质粒pOAD2，芳香烃降解质粒pNL1等。
• 抗性特征、代谢特征、修饰寄主的生活方式等。
‹# ›
1、抗性质粒 包括抗菌素抗性（R）质粒和金属抗性 质粒。 R质粒的进化、转移和扩散给抗菌素治 疗带来很大麻烦，是医学所面临的重大 问题之一。
‹# ›
2、毒力质粒 许多细菌的致病力和毒性与质粒有关，如大肠杆菌肠毒素和定居抗 原，破伤风毒素，炭疽毒素，溶血毒素，苏云金芽孢杆菌的杀虫晶 体蛋白，植物冠瘿病（Ti质粒）和发根病（Ri质粒）。
‹# ›
本节内容结束
• 作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能
1、分子较小，可携带比较大的DNA片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多 克隆位点 multiple cloning sites，MCS） 。
M13mp系列 pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16,
pCV Pel oBAC系列
PCYPAC1
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
第一节 质粒的一般特性 第二节 质粒DNA的分离与纯化 第三节 质粒载体的构建与类型 第四节 重要的大肠杆菌质粒载体 第五节 质粒载体的稳定性问题