防腐剂的防腐效力检测

防腐剂的防腐效力检测

本研究结合美国药典（USP）、欧洲药典（EP）及中国药典（2010，防腐效力检测的指导原则）等对某防腐剂的防腐效力进行检测，从实验用菌种、实验方法等方面考察，建立某防腐剂的防腐效力的检测方法并评价相应防腐剂的防腐效力。

防腐剂一般是化学物质，经常会受环境因素的影响降解或失活。为确保防腐剂效力的有效性，有必要对含防腐剂最终产品的防腐效力进行科学有效的评价。

防腐效力检测实验程序

一、USP、EP防腐剂防腐效力检测实验方法介绍

USP、EP对防腐效力检测均有具体规定，虽然内容特别是判定标准有所不同，但所用的实验方法和原理是一致的：取一定量挑战性微生物（challenge microorganisms），接种至一定量的被测样品中，在规定温度下培养接种试样。在28 d的培养期内，于规定时间点取样，通过平皿菌落计数法（plate-count method）或其它方法测定接种样品中剩余的存活菌浓度，通过对比菌浓度下降值，判定样品是否符合规定。

二、检测用的微生物

USP、EP及中国药典推荐用的挑战微生物

挑战性微生物USP EP 中国药典

白色念珠菌Candida albican A TCC 10231 A TCC10231 ,

NCPF 3179, IP

48.72

CMCC(F)98001

黑曲霉Aspergillus niger A TCC 16404 A TCC16404 , IMI

149007, IP

1431.83

CMCC(F)98003

大肠埃希菌Escherichia coli A TCC 8739 A TCC8739 ,

NCIMB 8545,

CIP

53.126

CMCC(B)44102

铜绿假单胞杆菌Pseudomonas aeruginosa A TCC 9027 A TCC9027,

NCIMB 8626,

CIP82.118

CMCC(B)10104

金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus A TCC 6538 A TCC6538,

NCIMB 9518,

NCTC

10788 CIP4.83

CMCC(B)26003

试验所用菌株传代次数不得超过5代。我们选用的菌株为中国药典的规定菌种，前期工

作为使用本实验室保存和收集菌种。

三、培养基适用性检查

按照药典规定进行。

四、抑菌效力检测

1. 菌液的制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪胨大豆肉汤培养基或胰酪胨大豆琼脂培养基，经30~35℃培养18～24h, 备用。

接种白色念珠菌于沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基中，经25℃培养24~48h, 备用。

采用比浊法制成每毫升含菌数为108cfu的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，经23~28℃培养5~7天, 加入3~5ml含0.05%（ml/ml）的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，并用比浊法制成每毫升含孢子数为108cfu的孢子悬液备用。

2. 菌液浓度的测定方法（采用平皿法测定1ml菌悬液的菌数）

分别取上述菌液适量，用无菌0. 9%氯化钠溶液按10 倍系列稀释到适宜的稀释度, 取稀释液1ml 加入平皿中，平行制备两个平皿, 立即倾注45℃约15ml相应的琼脂培养基, 待凝固后细菌置30～35℃培养24～48h，真菌置23～28℃培养48～72h，逐日点计结果。按测定的菌数结果计算出各菌液的浓度。

3. 供试品接种

取20m l 供试品5 份, 分别加入上述已备妥的菌悬液或孢子悬液各适量(接种菌液的体积不超过供试液体积的1%, 使最终挑战菌浓度为105~106cfu/ ml) 作为供试液，同时设不含防腐剂的菌悬液阴性对照。

样品接种后在20～25 ℃避光密闭保存，在规定的时间点（分别经0、6、24、48 h 及7、14、28d 等规定时间）取样，用平皿菌落计数法（按菌液浓度的测定方法）测定样品中剩余菌浓度，根据菌数测定结果，计算1ml（或1mg）供试品各试验菌所加的菌数及各间隔时间的菌数，并换算成lg值。最终判定所测结果是否符合规定。实验数据输出见表1和表2

表1 接种不同时间段各菌存活浓度

注;每组均为三次独立结果

4. 防腐剂的中和方法研究（此项内容，不知您是否需要做？）

在检测时间点，需先消除（中和）产品中防腐系统剩余的防腐效力，再用平皿菌落计数法计菌数，才能准确测定防腐剂的防腐效力，否则剩余防腐剂的效力将影响测定结果，以致高估防腐效力。

中和方法的验证（validation）

USP明确规定，对比以下3个处理组的生长结果验证中和方法。

●第1组测试组，该组产品按规定中和方法处理，然后加入低浓度挑战性微生物（100

cfu/mL以内），培养其生长；

●第2组是蛋白胨对照组，用蛋白胨代替样品，同法进行中和处理，作为测试液，接种及

恢复生长的操作同第1组；

●第3组是验证组，直接取未实施中和方案的同浓度的菌液进行测试。

如果测试组和蛋白胨对照组菌恢复生长结果近似，则证明中和剂具有足够的中和效力；如果蛋白胨对照组与验证组菌恢复生长结果相似，则证明中和剂的毒性是合格的。

附：需购置的试剂药品