流式细胞仪的基本结构
临床医学检验：流式细胞仪及免疫自动化仪器找答案真题
临床医学检验：流式细胞仪及免疫自动化仪器找答案真题1、单选藻红蛋白(PE)的荧光发射强度比FITC强多少倍()A．9B．19C．190D．1900E．19000正确答案：B2、单选以催化反应或能量传递参与（江南博哥）发光的最常用酶标记物是() A．HRP或ALPB．HRP或THBC．ALP或TMBD．ALP或OPDE．三联吡啶钌正确答案：A3、单选定时散射比浊分析中，如果待测标本的预反应时间段的光散射信号超过预设阈值时，则应()A．进行全量样本检测B．将待测标本稀释后重新测定C．照常进行反应D．测量结果更可靠E．增加抗体的浓度后重新检测正确答案：B4、填空题根据发光反应中形成激发态分子的能量来源不同，将发光又分为______________、__________________、________________。
正确答案：光照发光；生物发光；化学发光5、填空题荧光信号的放大测定通常使用______________和____________________。
免疫测量中最常使用的是______________。
正确答案：线性放大器；对数放大器；对数放大器6、单选光束成形器的作用是将激光器发射的激光束聚焦成下列哪种光斑() A．高15μm、宽57μm的椭圆形光斑B．高10μm、宽57μm的椭圆形光斑C．高15μm、宽50μm的椭圆形光斑D．高10μm、宽50μm的椭圆形光斑E．高20μm、宽60μm的椭圆形光斑正确答案：A7、单选下列可与蛋白质、半抗原激素及核酸等物质结合的标记物是()A．吖啶醇类B．三丙胺C．鲁米诺类D．三联吡啶钌E．三氧乙烷正确答案：D8、单选前向散射光(FS)信号的强弱与细胞的哪项成正比() A．体积大小B．细胞性状C．颗粒多少D．位移速度E．荧光强弱正确答案：A9、单选对培养细胞的分选不宜选择高速的最可能原因是() A．细胞太多B．细胞太大C．细胞膜脆弱D．细胞核脆弱E．胞浆所占比例大正确答案：C10、单选免疫透射比浊分析制备标准曲线时，标准品至少应设() A．2个浓度点B．3个浓度点C．4个浓度点D．5个浓度点E．1个浓度点正确答案：D11、单选目前的流式细胞仪的分选速度可达到()A．20000个/秒B．10000个/秒C．7000个/秒D．5000个/秒E．3000个/秒正确答案：C12、单选电化学发光免疫分析中，最常使用的方法是()A．双抗体夹心法B．竞争法C．间接法D．直接法E．补体参与的结合法正确答案：A13、单选被分选细胞形成液滴时会被()A．染色B．充电C．酶标记D．抗体捕捉E．以上都不是正确答案：B14、单选流式细胞仪的基本结构组成是()A．液流系统B．光学系统C．计算机系统D．液流系统、光学系统和信号处理系统E．液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统正确答案：E15、单选其作用为反射较长波长的光而通过较短波长的光的是()A．气冷氩离子激光器B．分色反光镜C．光束成形器D．透镜组E．光电信增管正确答案：B16、填空题Rayleigh的设计原理是，散射光的强度与复合物的量成________________，与散射夹角成______________，与波长成________________。
流式细胞仪结构
流式细胞仪结构流式细胞仪是一种强大的生命科学工具，其重要性在于可以对单个细胞进行评估和分析。
它能够快速确定细胞的数目、大小、形态、表面分子、染色体、活性等，并在高速流动的下完全自动地完成。
流式细胞仪的主要结构包括以下部分：1. 液体系统液体系统是流式细胞仪中最重要的组成部分之一。
液体系统由注射泵、样本针头、流体管路、加热器、监测器和槽等组成。
液体系统的主要作用是将样本注入流式细胞仪仪器内，同时将相应的分析结果输出到计算机屏幕。
注射泵的作用是控制流速和流量，样本针头的作用是将样本输入到流道中，监测器则能够不断监测流速，并将数据反馈到计算机上。
2. 光源系统流式细胞仪的光源系统由激光和滤光片等组成。
激光器使用单色光源，并可以发出高能量光束。
这些光束被滤光片过滤并汇聚到一个小的比色镜上，该比色镜的作用是使光线垂直于样品流。
此外，液晶过滤器可以用来调整激光器的波长，以确保它与特定的荧光分子发生共振。
3. 光学系统光学系统包括透镜、光学过滤器、放大器、光电探测器、信号处理器和计算机等。
透镜和光学过滤器的作用是收集、过滤和分离出不同波长的荧光分子，以使其可观测。
听放大器的作用是扩大信号并传递给光电探测器，光电探测器则将光信号转换成电信号，并传输到信号处理器中进行处理和分析。
最后，计算机对数据进行处理和分析，并随时向用户提供结果。
4. 流道系统流道系统由分析室、注样装置、样本流道及势能槽等若干部分组成。
它的主要作用是将生物细胞按照规则排列并流过分析室。
分析室内有一平台，其底部有一个窄缝，当样本流过窄缝时，它们被分离成单个荧光分子。
分析室内有一套散射器和荧光筛选器，它们能够检测样品中的散射和荧光信号。
流道系统内的样本流道和势能槽都是非常精细的，它们可以精确地控制样品流动并对其施加适当的压力，以保证准确和稳定的数据输出。
总之，流式细胞仪是一个复杂而精密的仪器，它由许多精良的部件组成，每个部件都具有自己的重要作用。
流式细胞仪的原理及应用
流式细胞仪的原理与使用一、定义流式细胞仪（flow cytometer）：是集光电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学、单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。
流式细胞术（flow cytometry , FCM）：是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识及技术。
二、基本结构1.流动室和液流系统流动室由样品管、鞘液管、喷嘴等组成，由透明稳定的材料（化学玻璃、石英等）制成，是液流系统的核心部分。
样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力下从样品管射出。
鞘液由鞘液管由四周流向喷孔，包围在样品外周后由喷嘴射出。
2.激光源和光学系统光源根据被激发物质的激发光谱而定，常用弧光灯和激光。
常用的弧光灯为汞灯，激光器多为氩离子激光器、氪离子激光器或染料激光器。
经过特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发荧光供收集检测。
3.光电管和检测系统荧光染色或荧光标记后的细胞受到合适的光激发后产生的荧光通过光电转换器转变为电信号进行测量。
通常使用光电倍增管（PMT）。
PMT响应时间短，为ns数量级，具有较强光谱响应特性，200～900nm光谱区内光量子产额较高，其增益从103到108可连续调节，有利于弱光的测量。
由PMT输出的电信号放大后输入分析仪器。
流式细胞仪中一般备有两类放大器。
一类为线性放大器，即输出信号辐度与输入信号成线性关系，适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例如DNA测量。
另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。
在免疫学测量中常使用对数放大器。
免疫分析时需要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，其荧光强度相差1～2个数量级；在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。
此外还有调节便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。
流式细胞仪
三）淋巴细胞分类
CD3(T细胞，CD4、CD8))、CD19 （B细胞）、CD16、CD56（NK细胞）， 原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫 性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观 察与预后判断、移植免疫检测等。
R1 M1 M1
流式细胞术检测细胞表型
四）白血病的免疫分型
流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素 标记的单克隆抗体作分子探针，多参数 分析白血病细胞的免疫表型，了解被测 白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。
流式细胞仪数据分析
点图分析
流式细胞仪数据分析
直方图分析
图中100～101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞
五、 流式细胞术的应用
细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面积 核浆比例 DNA含量与细胞
周期 RNA含量 蛋白质含量
……
细胞功能
UL
254
2.40 37.47 461.36
UR 1067 10.08 816.86 468.89
LL 5291 49.98 19.57 4.41
LR 3975 37.55 418.80 9.87
图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死
Date acquired: 14-Jan-03 File: 7Gy 4hr.001 Source: dongbo DIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04
FCM分析白血病免疫表型, 快速、特异、 准确，重复性好，能区分细胞起源、划 分其分化发育阶段等，对白血病的诊断 与分型、治疗方案选择与预后判断、发 病机理研究等有重要价值。
流式细胞仪的基本结构
流式细胞仪的基本结构
流式细胞仪是一种广泛用于生物医学研究和临床诊断的仪器，它可以用来分析和计数细胞、测定细胞大小、形状和复杂性，并检测细胞表面和内部分子的表达。
流式细胞仪的基本结构包括以下几个主要部分：
1. 激光系统，流式细胞仪使用激光来激发样品中的荧光染料或标记物，从而检测细胞的特定性质。
激光系统通常包括一个或多个激光器，用于产生不同波长的激光光束。
2. 样品注射系统，样品注射系统用于将待测样品引入流式细胞仪。
通常采用注射器或者自动进样系统来实现样品的引入。
3. 流动系统，流动系统包括样品的流动通道、流速控制装置和检测单元。
样品在流动通道中通过激光束，检测单元用于测量样品中的荧光信号。
4. 检测单元，检测单元包括光学透镜、滤光片和光电探测器，用于接收样品中的荧光信号，并将其转换为电信号。
5. 数据分析系统，数据分析系统用于处理和分析从检测单元中获得的数据，通常包括计算机和相应的软件。
流式细胞仪通过这些基本结构的协同作用，可以实现对细胞的高速、高通量、多参数分析，为生物医学研究和临床诊断提供了强大的工具。
随着技术的不断进步，流式细胞仪的功能和性能也在不断提升，使其在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等领域的应用变得更加广泛和深入。
临床医学检验：临床检验仪器题库考点(题库版)
临床医学检验：临床检验仪器题库考点（题库版）1、问答题如何对BCA进行分类？正确答案：按自动化程度分半自动血细胞分析仪、全自动血细胞分析仪、血细胞分析工作站、血细胞分析流水线；按检测原理分电容型、光电型、激光型、电阻抗（江南博哥）型、联合检测型、干式离心分层型、无创型；按对白细胞的分类水平分二分群、三分群、五分群、五分群+网织红BCA。
2、多选制备型超速离心机主要用途包括（）。
A.细胞器和病毒分离纯化B.生物大分子分离纯化C.能使亚细胞器分级分离D.可用于测定蛋白及核酸的分子量E.分离细胞碎片正确答案：A, B, C, D3、单选下列不属旋转式黏度计维护的是（）。
A.每次测试完毕后均应进行冲洗B.清洗剪血板C.清除毛细管污染D.清洗剪液锥E.清除测试头严重污染物正确答案：C4、单选鉴别良、恶性肿瘤的特异指标为（）。
A.非特异性酯酶含量测定B.胞质抗原含量测定C.DNA含量测定D.过氧化物酶含量测定E.DNA倍体含量测定正确答案：E5、单选与RIA比较，IRMA最突出的特点是（）。
A.IRMA的反应速度更慢B.非竞争结合，使IRMA灵敏度更高C.抗体用量较少，但对K值要求更高D.反应参数与待测抗原含量成反比E.单位点IRMA采用固相抗体分离法正确答案：B6、多选生物芯片检测仪器是一种多学科高度结合的精密仪器，学科包括（）。
A.光学B.机械C.电学D.计算机E.现代分子生物学正确答案：A, B, C, D, E7、问答题简述Ⅲ级生物安全柜的性能特点。
正确答案：Ⅲ级生物安全柜是完全密闭、不漏气结构的通风安全柜。
工作空间内为经HEPA过滤器净化的无涡流的单向流空气。
安全柜正面上部为观察窗，下部为手套箱式操作口。
在安全柜内的操作是通过与安全柜相连接的橡皮手套进行的。
安全柜应维持至少120Pa的负压，方可确保人体与柜内物品完全隔绝。
进入气流经数个HEPA过滤器过滤后送入安全柜，排出气流应经双层HEPA过滤器过滤或通过HEPA过滤器过滤和焚烧来处理。
FCM技术的临床应用
FCM技术的临床应⽤流式细胞技术的基本原理和临床应⽤浙江⼤学医学院附属第⼀医院传染病研究所徐陈槐流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是利⽤流式细胞仪对细胞等⽣物粒⼦的理、化及⽣物学特性进⾏分析的⽅法。
它集中了单克隆抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。
利⽤流式细胞仪可以对细胞等⽣物粒⼦的理化及⽣物学特性(细胞⼤⼩、DNA 含量、细胞表⾯抗原表达等)进⾏定量、快速、客观、多参数相关的检测。
流式细胞仪的基本原理是采⽤流体动⼒学聚焦以保证细胞按同⼀⽅式逐⼀通过激光束(检测区)。
当样本流中的细胞经过流动室中的检测区时，椭圆形的激光束即可检测到细胞信号。
包括细胞的散射光以及细胞上标有的荧光染料发出的激光。
⼀、流式细胞仪的基本结构：流式细胞仪的流动室中有⼀长⽅形通道，加压的鞘液从通道底部进⼊流动室向上流动，检测区位于通道的中央。
当鞘液在通道中流动时，样本流被射⼊鞘液中，鞘液包裹着样本，但并不与其混合。
鞘液的压⼒将样本流聚焦，使其在流动室中逐⼀通过激光检测区。
根据激光束检查到的信号不同，将其分为前向散射光、侧向散射光及荧光。
激光束上的低⾓度散射光被称为前向散射光(FS)，主要反映细胞的⼤⼩；与激光束成90度⾓收集的散射光信号称侧向散射光(SS)，主要反映细胞的颗粒特性。
如SS可以区分淋巴细胞，单核细胞及粒细胞。
除FS和SS外，细胞亦可发出荧光(FL)。
根据所应⽤的试剂不同，这些荧光可以使仪器得到细胞的⼀些特征，如：FL可以⽤于确认分⼦，像表⾯抗原等。
⼆、光的收集：前向检测器⽤来收集前向散射光，当有散射光到达前向检测器，即会产⽣电压信号。
根据检测器收集到的光信号的不同，电压信号亦不相同。
侧向散射光波长488nm，较荧光强。
它是第⼀个从收集镜/空滤⽚装置中被分离出来的。
应⽤488nm 的⼆向⾊性长通滤⽚(488DL)在45度⾓时，使前向散射光偏转⾄SS检测器，同时⼜使波长较长的荧光通透过去。
流式细胞仪(Flow_Cytometer)基础简介
●
FCM的定义
流式细胞仪是指，使细胞（或其 他粒子）以单个方式依次高速通过激 发光束，采集细胞被光照时产生的各 种信号，对信号进行处理，幵对各参 数进行关联分析的一种仪器。
对比
流式细胞仪是一种特殊的显微镜
流式细胞仪
流动的细胞
数量大 高速分选
显微镜
静止的细胞样本
数量少 样本难以再利用
细胞群体特征量分布
流式细胞仪（Flow Cytometer) 基础简介
中科院生物物理研究所 中国科学院蛋白质科学研究平台 2005年3月 刘春春
Hale Waihona Puke 主要内容
流式细胞仪概要 流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪测量的对象
什么是流式细胞仪
●
流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
流式细胞仪基本结构
非荧光信号
颗粒度
细胞大小
散射光信号区分裂解后的外周血细胞群
荧光信号
荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量
多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
PI＋Annexin－V细胞凋亡检测
DNA 含 量 -PI Annexin-V
PE＋FITC荧光标记检测外周 血裂解后细胞群
光信号收集
光信号分离，导向，各探测通道PMT 接收幵转化为电信号。
激光束
侧向散射 光，荧光
1
二色镜 2
3
细胞
前向 散射 光
收集透镜
带通滤波片 光电倍增管
数据处理
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
医学专题流式细胞仪概述
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第一节 流式细胞仪的工作原理
一、生物学颗粒分析原理
流式细胞技术是在单细胞水平上，对于处在快速直线流 动状态中的大量细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定 量分析和分选的技术，现已成为现代医学研究最先进的 分析技术之一。应用流式细胞仪对于处在快速直线流动 状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分 析和分选的技术称为流式细胞技术。
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当某类细胞的特性与要分
选的细胞相同时，流式细胞
仪就会在这类细胞形成液滴
时给含有这类细胞的液滴充
以特定的电荷，带有电荷的
液滴向下落入偏转板间的静
电场时，依所带电荷的符号
分别向左偏转或向右偏转，
落20入21/指7/19定星的期一收集器内。
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喷嘴的振动频率即每秒钟产生水滴的数目。当喷嘴直径为 50μm时，信号频率为40kHz，则每秒钟产生4万个水滴。若 每秒钟流出的细胞是1000个，则平均每40个水滴中只有一个 水滴是有细胞的，其他皆为空白。
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2．逻辑电路 为了分选细胞，需要细胞在经过测量区时判断出哪个细
胞满足了分选的条件，并产生一个逻辑信号，此信号驱动 充电脉冲发生器，使之产生充电脉冲。
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3．水滴的充电与偏转 当水滴从流束上将要断开时给整个流束充电，则水滴从流
束上断开后便带有同极性的多余表面电荷。下落的水滴通过 一对平行板电极形成的静电场时，带正电荷的水滴向带负电 的电极板偏转，这样就可用容器收集水滴。
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（六）FCM测量数据的存贮、显示与分析 目前FCM数据的存贮的方式均采用列表排队(List Mode)
流式细胞仪工作原理与应用范围
流式细胞仪工作原理与应用范围2008-11-01 10:30流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为试验室的“CT”。
流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。
流式细胞仪结构
流式细胞仪结构流式细胞仪（Flow Cytometry）是现代生物学实验室中常见的一种细胞分析技术，可以广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域。
它通过将细胞悬浮液与荧光标记的抗体或染料结合，并通过流动将细胞单个地通过射流固定到流式细胞仪的聚焦点，然后检测并记录细胞的光学信号，根据细胞的形态、大小、荧光强度等特征实现对细胞的细致分析。
流式细胞仪的基本结构包括四个部分：样品注射系统、激光系统、光学系统和信号检测系统。
样品注射系统是流式细胞仪中的第一个关键部分，它负责将含有被检测细胞的悬浮液引入流式细胞仪的样品流道中。
常见的样品注射系统由进样针筒、样品流道和压力控制系统组成。
进样针筒可以用来控制悬浮液样品的流动速度和稀释倍数。
样品流道是一个细长的通道，用于引导悬浮液进入流式细胞仪中的激光聚焦点。
压力控制系统则用来控制样品的流速和稳定性。
激光系统是流式细胞仪的核心部分，通常由一个或多个激光器组成。
激光器发射的激光束经由一系列光学元件，如透镜、分束镜和滤光片等，被聚焦到流式细胞仪中的检测区域。
常见的激光器有氩离子激光器、固体激光器和半导体激光器等，它们可以发射不同波长（通常为UV至近红外）的激光束，用于激活荧光染料或激发细胞表面标记物。
光学系统负责将激光聚焦在流式细胞仪的检测区域，并收集散射光和荧光信号。
光学系统通常由多个光学透镜和孔径光阑组成。
散射光较小角度散射（Forward Scatter, FSC）和大角度散射（Side Scatter, SSC）可以提供细胞的形态和粒度信息。
荧光信号通过荧光滤光片进行分光，然后通过光电二极管（Photomultiplier Tubes，PMTs）接收和放大，各个PMT检测细胞上各个波长范围的荧光信号。
信号检测系统将从光学系统接收到的荧光和散射光信号转换成电信号并记录。
荧光信号被光电二极管转换成电压信号，然后被模数转换器（Analog-to-Digital Converter, ADC）转换为数字信号并存储到计算机中。
流式细胞仪原理
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland–Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
BD-FACSCalibur流式细胞仪操作手册
BD FACSCalibur流式细胞仪一、BD FACSCalibur基本结构1.1仪器本体：1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。
2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射以BD FACSCalibur 基本型为例➢FSC Diode 只收488 nm波长散射光➢SSC PMT 只收488 nm波长散射光➢FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm）➢FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm）➢FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）3. 仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。
流速控制：LO：样品流速：12 l /minMED：样品流速：35 l /minHI: 样品流速：60 l /min功能控制：•RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。
（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。
）•STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。
•PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。
PRIME 结束，仪器恢复STANDBY状态。
4. 储液箱抽屉：在主机左下方之储液箱抽屉。
可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。
请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。
•鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。
装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约 3小时。
筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。
鞘液筒盖上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。
•废液筒：位于抽屉右侧，容积4升。
筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。
流式细胞仪(Flow Cytometer)原理及应用-12.4
7 recip 9-22 9-12
Chromomycin A3
（GC）
结束语
流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很 强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑 战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，在科 研领域灵活运用这项技术，报告最科学、最真实 的客观数据，是我们的目标。
单参数直方图（Histogram）
二维等高图和密度图
Pseudo 3D Plot
3D Plot
便于数据统计 不同的细胞群 可以用不同的颜 色标记 主要表达方式
二维点图Dot Plot
光谱交叉
4 colors - simultaneous collection
FITC PE PETR
PE-CY5
侧向散射光(linear) 侧向散射光
前向散射光 (linear)
CD14 PE (log) CD45 FITC (log)
R1=单核细胞 (CD14+ve) R2=淋巴细胞 (CD45>单核细胞) R3=中性粒细胞 (CD45<单核细胞)
细胞分选
流式细胞仪的测量对象
大小 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 大小范围： 大小范围：0.2uM-300uM。 。 对象类型 细胞类型： 细胞类型： 高等真核细胞； （1） 高等真核细胞； 酵母； （2）酵母； 细菌； （3）细菌； 多细胞的聚集体，如胰岛等。 （4）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒： 非生命颗粒： 和其它细胞器以及乳化微球等。 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。
流式细胞术操作流程
样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋 标记 单细胞 悬液 检测 荧光抗体
流式细胞仪PPT课件
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I I 流式细胞仪的基本结构（３）
细胞通过测量区时信号的产生：电压脉冲的形成
罗敏
流式细胞仪
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I I 流式细胞仪的基本结构（３）
散射光信号 细胞在通过激光测量区时，在空间360°立体角 的所用方向散射光线，散射光信号与细胞大 小、形状、质膜及细胞内部的折射率有关。 在流式细胞仪中，通常在前向角和侧向角接 收和检测细胞散射光，前者的检测器多用 硅 光电二极管，后者的检测器多用光电倍增管。
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流 式 细 胞 仪--发展历史
20世纪80年代，流式细胞仪的数据采集、存 储、显示、分析日趋完善，随着样品制备方 法的增加，新的荧光染料和细胞标记物的出 现，使流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。
20世纪90年代，与之配套的标本制备仪和自 动进样器的问世，以及适合临床应用的单克 隆抗体的增加，使流式细胞仪逐渐从科研单 位进入医院的中心实验室和检验科，成为现 代化的临床检验仪器的一部分。
荧光显微镜 环状结构
样品管
鞘液
样品液
图：显微检测流动室示意图
罗敏
流式细胞仪
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I I 流式细胞仪的基本结构（２）
（1）
（2）
图：四种典型流动室示意图（１）
罗敏
流式细胞仪
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I I 流式细胞仪的基本结构（２）
（3）
（4）
图：四种典型流动室示意图（2）
罗敏
流式细胞仪
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I I 流式细胞仪的基本结构（２）
含量等理化指标。
示意图
罗敏
流式细胞仪
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I 流式细胞仪的基本原理
细胞分选原理：
在压电晶体上加上频率为30kHz的信号，使之产生同频率的 机械振动，流动室也随之振动，这样通过测量区的液柱断 裂成一连串均匀的液滴。
临床医学检验：临床检验仪器考试资料三
临床医学检验：临床检验仪器考试资料三1、填空题流式细胞仪的基本结构由液流系统光源、信号接受系统、信号处理系统、（）五部分构成，制备单细胞悬液是进行流式细胞仪分析最关键的第一步。
正确答案：细胞分选器2、多选在（江南博哥）发光酶免疫分析中，抗原抗体反应模式主要有（）。
A.固相抗原竞争法B.双抗体夹心法C.双抗原夹心法D.PAP法E.补体法正确答案：A, B, C3、多选对于连续流动转头，下列说法中正确的是（）。
A.用于高速分离较小的颗粒物质B.利用离心淘析技术C.被分离组份在无菌和低温的条件下能保持活性D.大容量转头转速低E.回收率高正确答案：A, B, C, E4、名词解释反应管温控模式正确答案：仪器根据探测器所探测到的温控模块的温度由计算机计算出样品管内或PCR板孔内样品液的温度来进行控制。
5、单选基于ISE的干式电解质分析仪多层膜片中不存在的是（）。
A.离子选择性敏感膜B.参比层C.氯化银层D.银层E.样品层正确答案：E6、多选以下属于密度梯度离心法的有（）。
A.差速离心法B.沉降速率法C.速率区带离心法D.等密度区带离心法E.分析离心法正确答案：C, D7、单选毛细管等速电泳常用于分离（）。
A.小离子、小分子、肽类及蛋白质B.大离子、小分子、肽类及蛋白质C.小离子、大分子、肽类及蛋白质D.小离子、中分子、肽类及蛋白质E.大离子、中分子、肽类及蛋白质正确答案：A8、单选毛细管电泳型测序仪电泳时仪器显示无电流，最常见的原因是由于（）。
A.电极弯曲B.电泳缓冲液蒸发使液面降低C.毛细管未浸入缓冲液中D.毛细管内有气泡E.测序样本未注入毛细管中正确答案：B9、问答题简述实验室流水线的组成及其功能。
正确答案：实验室流水线由标本前处理系统、分析系统和分析后输出系统（样品后处理存储区）组成。
标本前处理系统包括：起始平台：基本作用是读取样品架识别码和标本条形码并把有效标本传送到下一流程）；自动离心模块：系统自动按实际标本量自动平衡后进行离心；开盖模块：完成去除试管盖的功能，识别已经开盖的标本；在线分注模块：根据不同测试项目将标本从原始试管中取出放置到子标本管中，并能生成次级条形码粘贴到子标本管上。
流式细胞仪基本原理及应用
流式细胞术(Flow Cytometry，FCM): 是应用流式细胞仪，对处于快速流动液 体中的细胞或生物颗粒进行多参数、 快速测量和定量分析，以及分选的技 术。
All rights reserved by Dr Baiqing LI
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Bengbu Medical College Department of Immunology
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台式机——FACSCalibur
双激光 488nm 635nm
四荧光参数
分选、浓缩系统
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（二） 流式细胞仪可检测的细胞的参数：
散射光信号
前向角散射光（FSC, Forward Scatter）
入射光的前向 (5)散射光信号,
可反映：细胞相对大小及其表面积
侧向角散射光（SSC, Side Scatter）
入射光90角的散射光信号，
可反映：细胞颗粒性程度
（胞内成分和构造和表面结构的复杂性）
20信号检测和分析当细胞携带荧光素通过激光照射区受到激发产生不同波长的代表细胞内不同物质的荧光信号荧光信号由光电接收器接收转变为电脉冲信号电脉冲信号经ad转换成数字信号数字信号传送到计算机进行储存作图和统计分allrightsreserveddrbaiqinglibengbumedicalcollegedepartmentimmunology引水枢纽萨兰河倒虹吸古河倒虹吸恰里卡尔水电站和扬水站五座建筑物主体结构基本完好但由于自然老化各战争毁坏结构表面有磨损剥蚀弹坑及麻面有些上部结构破坏严重
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流式细胞仪主要由以下五部分构成：流动室及液流驱动系统；激光光源及光束形成系统：光学系统；信号检测与存储、显示、分析系统；细胞分选系统(图4-3)。
1．流动室和液流系统是流式细胞仪的核心部件。
流动室由样品管、鞘液管和喷孔等组成。
常用石英等透明、稳定的材料制作。
样品管储放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘液包绕通过流动室内的一定孔径的孔。
由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。
检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞啦单行排列依次通过激光检测区。
为了保证液流速度稳定。
一般限制液流速度小于10 m／s。
流动室孔径有60 μm、100μm、150μm、250 μm 等多种。
2．激光源和光学系统经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。
常用的激光管是氩离子气体激光管，它的发射光波长488nm，此外可配备氦氖离子气体激光管(波长633nm)和(或)紫外激光管。
光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。
氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm
和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80％；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。
免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm
以上，可使用染料激光器。
将有机染料作为激光器泵浦的一种成分，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。
例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodanline 6G水溶液的染料激光器，则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。
为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。
因此需将激光光束经透镜会聚。
流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，大致可分为流动室前和流动室后两组。
流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔的将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚
焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度地减少杂散光的干扰。
为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。
带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤片区段的光线滤除或通过。
例如使用525nm带通滤片只允许FITC发射的525nm绿光通过。
长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。
在免疫分析中常要同时探测两种咀上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。
在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22μmx66μm)，使通过激光检测区的细胞受照强度一致。
3．光电管和检测系统经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。
光电倍增管(photomultiplier tube，PMT)最为常用。
PMT的响应时间短，仅为数秒；光谱响应特性好，在200～900nm 的光谱区，光量子产额都比较高。
光电倍增管的增益从103到108可连续调节，因此对弱光测量十分有利。
也有用硅光电二极管的，它在强光下稳定性比PMT 好。
从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。
流式细胞计中一般备有两类放大器。
一类是输出信号幅度与输入信号呈线性关系，称为线性放大器。
线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例如DNA测量等。
另一类是对数放大器．输出信号和输人信号之间成常用对数关系。
在免疫学测量中常使用对数放大器。
因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，它们的荧光强度相差1～2个数量级；而且在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。
4．计算机和分析系统经放大后的电信号被送往计算机分析器。
多道分析器出来的信号再经模，数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存储于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。
计算机的存储容量较大，可存储同一细胞的6～8个参数。
存储于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，最后给出结果。
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