血清蛋白盐析及层析111111

（4）洗脱 洗脱：继续用0.02mol/L，pH 6.5 洗脱 NH4Ac溶液 洗脱，随时用20%磺基水杨酸检 查流出液中是否含有蛋白质，一旦出现蛋白 质，立即收集. 白蛋白收集5毫升。如果是r球蛋白收集4毫升。然后继续洗脱，并用 BaCl2检查SO42-。待确定硫酸根离子已排除, 方可停止洗脱。 （5）再生 再生：用过的凝胶层析柱，可用大量的 再生 0.02mol/L，pH 6.5 NH4Ac 淋洗，使之再生 平衡，即可重复使用。
（2）装柱： ）装柱： 将层析柱垂直固定于铁架上，在层析柱内加 0.02mol/L,pH 6.5 NH4Ac缓冲液约3ml，排除“死 体积”内的气泡。 然后将上述处理好的`浓稠的凝胶悬液沿玻璃棒 倒入柱内，注意不要产生气泡，凝胶要均匀，床表 面要平整。装柱后，接上恒压贮液瓶，打开恒流泵， 调整流速，用0.02mol/L， pH 6.5 NH4Ac 洗涤平衡。 （3）加样： ）加样： 取下贮液瓶小心控制流速 ，使柱上缓冲液面 刚好降到凝胶床表面，关闭恒流泵。立即用滴管取 1.6ml白蛋白或0.8ml r-球蛋白样品。小心加到凝胶 床的表面，要先中央，然后迅速沿柱内壁转一周。 最后打开开关，控制流速，当样品进入凝胶表面时， 用0.5~1ml缓冲液洗涤管内壁，反复2~3次，以洗 掉沾在管壁上的样品。
血清蛋白盐析及分 子筛层析脱盐 赵建军 曲宁 夏婷 孟繁新
血清蛋白盐析及分子筛层析脱盐 A、蛋白质盐析原理 、
本实验先用盐析法对血清蛋白进行初步分离， 在半饱和硫酸铵溶液中，血清白蛋白不沉淀，而 球蛋白沉淀。离心后，白蛋白主要在上清液中， 沉淀的球蛋白加少量蒸馏水使之溶解。由于血清 白蛋白和球蛋白的分子量比硫酸铵大的多。因而， 可用分子筛层析法除去盐析后的白蛋白或球蛋白 样品中的硫酸铵，使白蛋白或球蛋白得以进一步 纯化。
器材与试剂
1、器材 、 （1）层析柱 ） （2）移液管 ） （3）烧杯 ） （4）滴管 ） （5）玻璃管 ） （6）部分收集器 ） （7）恒流泵 ） （8）核酸蛋白检测仪 ） （9）离心机 ） （10）试管 ） （11）滤纸 ） （12）剪刀、镊子 ）剪刀、 （13）朔料反应板 ）
2、试剂 、 （1）0.3mol/L pH 6.5 醋酸铵缓冲液； （2）0.02mol/L pH6.5 醋酸铵缓冲液； （3）饱和硫酸铵溶液； （4）20液
B、分子筛层析（Molecular chromatography）基 分子筛层析（ 分子筛层析 ） 本原理： 本原理：
分子筛层析又称凝胶排阻层析(Gel exclusion 分子筛层析又称凝胶排阻层析 chromatography)、凝胶过滤（Gel filtration）， 、凝胶过滤（ ）， 分子筛层析是指混合物随流动相经固定相（凝胶）移动 时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。凝 胶是一种不带电荷的具有三维空间结构的多孔网状物质。凝 胶的每一个颗粒的细微结构就像一个筛子，小的分子可以进 入凝胶网孔而大的分子则被排阻于凝胶颗粒之外，因而具有 分子筛作用，又因整个层析过程一般不变换洗脱液，好像过 滤一样，故也称凝胶过滤。
a.交联葡聚糖（商品名为Sephadex） 以右旋葡萄糖为残基的多糖。分子间是a-1,6糖苷键，分 支为1，3糖苷键。以环氧丙烷为交联剂，交联度越大，网孔 结构越密。反之，亦然。不同型号的Sephadex用G表示，G 值越大孔径也越大。 b.聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrytamine） 其组成单位是丙烯酰胺（单体）和交联剂-甲叉双丙烯酰 胺聚合而成的。 c.琼脂糖凝胶（Sepharose） d.交联葡聚糖LH-2。 是交联葡聚糖的羟基被羟丙酰基取代，多用于分离脂溶 性物质。
现象及解释： 现象及解释：
结果与讨论： 结果与讨论：
当含有大小不同分子的混合物加到层析 柱中，这些物质随洗脱液的流动而移动。由 于大分子物质（分子量大）不能进入凝胶颗 粒内部，就沿着凝胶颗粒间隙随流动相（或 洗脱液）移动，流程短，移动速度快，先流 出层析柱。而分子量小的物质，可通过凝胶 颗粒网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来， 故流程长，移动速度慢，后流出层析柱。从 而使混合物中的各组份分离开来。
也就是说，分子筛层析是按溶质分子的 大小，分别先后流出层析柱，大分子先流出， 小分子后流出。 当两种以上不同分子量的分子均能进入 凝胶颗粒内部时，则由于它们被排阻和扩散 程度不同，在层析柱内所经过的路程长短不 同和时间不同，从而得到分离。
凝胶层析中四种常用的凝胶是： 凝胶层析中四种常用的凝胶是：
３．操作： 操作：
a、硫酸铵盐析 取2ml血清于离心管中，边摇边缓慢滴 、 加饱和硫酸铵溶液2ml，混匀后室温放置10分钟，离心 3000r.p.m/10分钟。用滴管小心吸出上层清液于另一试管 中，作纯化白蛋白用，沉淀加入0.8ml蒸馏水，振摇使之 溶解，作纯化γ-球蛋白之用。
b、分子筛层析脱盐 （1）凝胶Sephadex-G-25的处理： 1 凝胶Sephadex- 25的处理： Sephadex 的处理 取Sephadex-G-25,30克，加到1000ml蒸馏水中， 轻轻 摇匀，置水浴中煮沸2小时，此间需经常摇 动以使气泡逸出，取出冷却，待凝胶颗粒沉降后， 倾去带有细微悬浮物的上层液，再加入2倍量的 0.02mol/L,pH 6.5 NH4AC缓冲液并混匀，静置片 刻，待绝大部分沉降后，倾去不沉的很细小微粒。 将上述处理后的凝胶，最好再用水泵抽，排除凝 胶内的气泡。