诱变育种

化学诱变剂
化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。 化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。 使用化学诱变剂的优缺点： 1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射 更有效。
Hale Waihona Puke Baidu
2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合 适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿， 一个蒸气罩。而用电离辐射±行工作时，设备费 用大，并要注意安全性。 3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非 常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，，且 切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感， 甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。
剂量的表示方法：常用杀菌率表示诱变剂的剂量。 杀菌率 =（ m―n）/m ×100％ m：未被处理菌体长出的菌落数 n：被处理菌体长出的菌落数 ② 使用剂量：一般剂量↗诱变率↗，但达到一定剂量后 剂量↗诱变率↘。 以前，一般使用90%-99．9％以上细胞死亡的剂量。 而近来则倾向于采用杀菌率为70%-75％的剂量 在生产实践或科研中，要确定某个诱变剂的合适剂量， 是通过多次试验后才决定的，而且更换诱变剂或处理不 同的菌株，也还要重新进行试验。
(二)处理菌悬液的制备
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这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态 的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培 养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。
(三)诱变处理
根据前面有关诱变剂及诱变处理的介 绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处 理方案。
1、选择诱变剂的种类 在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果 下，应选用最方便的因素；而在同样方便 的情况下，则应选择最高效的因素。在物 理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在 化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为 显著的“超诱变剂”，如NTG。
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单一因子处理： 复合因子处理：
两种以上因素 先后使用 同时使用 单一因子重复使 用
简便有效的诱变方法：
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紫外线的照射最为方便。 化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止 反应的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种 较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板 上涂上出发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗 很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸 片），经培养后，在制菌圈的边缘挑取若干突变菌落， 分别制成悬浮液，然后将其涂在一般平板表面使长出 许多单菌落，最后可用影印培养法或逐个检出法
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变色圈法 透明圈法 生长圈法 抑菌圈法 梯度平板法
2、 摇瓶培养法
紫外线的诱变育种（细菌）
(一)要求
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紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长 为253.7A．灯与处理物的距离为15～30cm， 照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。 一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂 量死亡率控制在70%～80%为宜。
三、诱变育种步骤
•出发菌株的选择 •处理菌悬液的制备 •诱变处理 •中间培养 •分离和筛选
原始菌种 原菌种特性鉴定 纯化
诱变剂处理 计算存活率 复筛
斜面/肉汤培养
平板分离 观察形态变异， 小试 挑单菌落 移至斜面 良种保藏 中试
单孢子/单细胞悬液
初筛
诱变育种的程序
性能测定
致死率确定
出发菌株 或菌悬液
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诱变剂具有普遍性：某种诱变剂对高等动植物 有诱变作用,对微生物也有效。 选择简便有效的诱变剂： 物理诱变剂:紫外线 化学诱变剂：亚硝酸、亚硝基胍（NTG）、
氮芥、吖啶黄等
2、确定合适的剂量：
①剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段
的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所 以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂 用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择 合适的处理剂量。—致死率是最好的诱 变剂相对剂量的表示方法。
第四节分离和筛选
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筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初 步要求的分离菌落为目的，以量为主。 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。 因此在具体方法上就有差异. 例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某 些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小 来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减 少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后 才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断 结合自然分离，纯化菌株。
效价：指有效成分的浓度。1ug/ul称为1 单位
第二节准备工作
了解影响菌种生长发育的主要因素
培养基 斜面培养基制作技术 移种的密度 温度 湿度 药品＆原材料质量
了解影响菌株的菌落特征
区分不同菌落类型 区分不同菌落类型的原因
了解菌种特性及其生产性能的关系 建立准确的检测方法 合适的菌种保藏技术
第三节诱变剂和诱变处理
第二步为复筛阶段:
测定的菌株数目较少,准确性要求高,这样 可以通过重复测定,从中选出最好的菌株。 复筛常采用摇瓶或台式发酵罐进行放 大试验,以进行接近实际的生产性能测定。 经筛选后获得的优良菌株,进行保藏, 供生产需要时用。
以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：
可见，设计和采用效率高的筛选方案和方 法极其重要。
诱变
物理、化学或生物诱变方法
第一节诱变育种的作用
提高有效产物的产量 改善菌种特性 开发新产品
从青霉素产量看诱变育种
时间 1943 1943 1943 1945 1947 1955 1971 1977 目前 发酵单位(u/ml) 100 250 500 ～850 ～850 ～8000 ～2万 ～5万 5～10万
选出突变种。
(四)中间培养
由于在发生了突变尚未表现出来之前，有 一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀 释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将 突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和 获得稳定菌株都是极为重要的。
方法
让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时， 以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以 得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现 出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平 皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于 一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛 选结果的不稳定和将来的菌株退化。
整个筛选工作分两步比较好。 第一步为初筛阶段:选出菌株数目要多,但准确性 要求不高，基本可以不让高产变异菌株遗漏,又可以减 少许多工作量。 一般采用一些方法加以简化，如利用形态突变直接淘 汰低产变异菌株，或利用平皿反应直接挑取高产变异菌 株等。 平皿反应是指每个变异菌落产生的代谢产物与培养 基内的指示物在培养基平板上作用后表现出一定的生理 效应，如变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等，这些效 应的大小表示变异菌株生产活力的高低，以此作为筛选 的标志。 常用的方法有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块 培养法等。
第一轮：
一个出发菌株→→→选出200个菌株→→→选出50株
（每瓶一株）
诱变处理
初筛
（每瓶四株）
→→→选出5株 40株
复筛
第二轮：
5个出发菌株→→→
诱变处理
40株 40株 40株
→→ → 选出50株 →→ →选出5株 40株
（每瓶一株） （每瓶四株）
初筛
复筛
第五节变异菌的一般筛选方法
1、 平皿快速检测法
诱变育种的意义
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当今发酵工业所使用的高产菌株，几乎都 是通过诱变育种而大大提高了生产性能。诱 变育种不仅能提高菌种的生产性能而且能改 进产品的质量、扩大品种和简化生产工艺等。 从方法上讲，它具有方法简便、工作速度快 和效果显著等优点。因此，虽然目前在育种 方法上，杂交、 转化、转导以及基因工程、 原生质体融合等方面的研究都在快速地发展， 但诱变育种仍为目前比较主要、广泛使用的 育种手段。
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物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、 γ—射线，快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效 的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫 外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用， 也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的 穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中 使用，否则有一定危险性。
活菌计数 性能初测
菌种纯化 诱变处理 平板涂布
性能精测
制备斜面孢子
活菌计数
初筛
复筛 放大试验
传代稳定性实验 菌种保藏 并用于生产
诱变育种的基本过程：
选择选择合适的出发菌株 ↓ 制备待处理的菌悬液 ↓ 诱变处理 ↓ 筛选 ↓ 保藏和扩大试验
(一)出发菌株的选择
1．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感， 容易达到好的效果。 2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像， 也是良好的出发菌株。 3 ．每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱 变能积累较多的提高。 4．出发菌株开始时可以同时选 2～ 3株，在处理比较 后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。
化学诱变剂剂量的确定
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决定化学诱变剂剂量的因素主要有诱变剂的 浓度、作用温度和作用时间。化学诱变剂的处 理浓度常用几微克~几毫克／毫升，但是这个 浓度取决于药剂、溶剂及微生物本身的特性， 还受水解产物的浓度、一些金属离子以及某些 情况下诱变剂的延迟作用的影响。
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一般对于一种化学诱变剂，处理浓度对不同 微生物有一个大致范围，在进行预试验时，也通 常是将处理浓度、处理温度确定后，测定不同时 间的致死率来确定适宜的诱变剂量。这里需要说 明的是化学诱变剂与物理诱变剂不同，在处理到 确定时间后，要有合适的终止反应方法，一般采 用稀释法、解毒剂或改变pH值等方法来终止反应。
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要确定一个合适的剂量，通常要经过多次试验，就 一般微生物而言，诱变频率往往随剂量的增高而增 高，但达到一定剂量后，再提高剂量会使诱变频率 下降。根据对紫外线、x 射线及乙烯亚胺等诱变剂 诱变效应的研究，发现正突变较多地出现在较低的 剂量中。而负突变则较多地出现在高剂量中，同时 还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，高剂量更 容易出现负突变。因此，在诱变育种工作中，目前 较倾向于采用较低剂量。
3、诱变处理方式
在诱变育种时，有时可根据实际情况，采用多种 诱变剂复合处理的办法。复合处理方法主要有三 类：第一类是两种或多种诱变剂先后使用；第二 类是同一种诱变剂的重复使用；第三类是两种或 多种诱变剂的同时使用。如果能使用不同作用机 制的诱变剂来做复合处理，可能会取得更好的诱 变效果。诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效 应，这对诱变育种的工作是很有价值的。
诱变剂的选择
1．碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使 用，回复突变率高，效果不大。 2．亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损 伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为 “超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变 剂之一。
3．吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全 中断。 4．紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体 巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的 缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。
第6章 诱变育种
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从自然界直接分离的菌种，一般而言其发 酵活力往往是比较低的，不能达到工业生 产的要求，因此要根据菌种的形态、生理 上的特点，改良菌种。以微生物的自然变 异为基础的生产选种的几率并不高，因为 这种变异率太小，仅为10-6~10-10。为了 加大其变异率，采用物理和化学因素促进 其诱发突变，这种以诱发突变为基础的育 种就是诱变育种，它是国内外提高菌种产 量、性能的主要手段。
5．要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞 体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分 是隐性的，特别是高产基因。 6．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变 谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使 细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是 作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作 用于休止期，就可选用孢子。
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筛选方案
Ø 实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分 为初筛和复筛两步进行。 Ø 初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把 生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌 株不至于漏网；因此，初筛工作以量为主，测定的精 确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。 Ø 复筛的目的：确认符合要求的菌株；——复筛以质为 主，应精确测定每个菌株的生产指标。
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被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml 左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不 要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅 拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射 时和照射后的处理应在红灯下进行。