动物细胞的死活鉴定和存活率的测定

（二）、动物细胞的死活鉴定和存活率的测定

一、实验目的及原理

1、掌握染料排除法鉴定细胞死活的原理。

2、学习用血球计数板进行细胞计数，以测定动物细胞存活率的方法。

原理：在显微镜下，从形态上很难区分死、活细胞。但是，死细胞可被某些染料如台盼蓝、伊红和苯胺黑等染上相应的颜色，而活细胞则不会被染色。因此，可根据细胞是否被染料着色来区分细胞的死活。

二、实验材料试剂

血球计数板、滴管、试管、倒置显微镜、超净工作台、电吹风、0.25%胰蛋白酶液、PE液、MEM+小牛血清培养液、0.4%台盼蓝

三、主要操作步骤

（一）细胞悬液的准备

1、75%酒精棉球消毒双手、工作台面、培养瓶和试管等。

2、将前一实验传代培养的细胞培养液倒入一个小试管中，暂存。

3、向培养瓶内加入5ml PE液，平放轻摇，放置2～5分钟后倒掉。

4、向培养瓶内加入0.5～o.8ml的0.25%胰蛋白酶消化液，放置2～４分钟后倒掉。拍打悬浮后，再将暂存的细胞培养液倒入，制备成单细胞悬液, （内含活细胞和死细胞）。

（二）细胞死活鉴定及计数

1、用95%酒精冲洗血球计数板及盖玻片，用电吹风吹干。把盖玻片覆在计数板上面，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液。

2、取吸管一支，伸入培养瓶中，吸取细胞悬液向一小试管中滴入6滴，再滴入0.4%台盼蓝3滴，混匀，染色2-3分钟。

如果细胞悬液含细胞过多，可先用MEM培养液稀释，稀释倍数视情况而定，然后再进行染色。

3、向计数板边缘处轻轻滴加1-2滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片间的空隙。

4、显微镜下观察和计数。

活细胞不着色，死细胞被染上蓝色。

分别统计角上的4个大方格内的活细胞和死细胞数，两个平台共8个大方格。

（三）数据的统计

活（死）细胞数（个/ml）=8个大方格中的活（或死）细胞总数/8 ⨯104⨯稀释倍数

细胞存活率%=（活细胞数/细胞总数）⨯%

四、实验结果

第一个平台，四个角的活细胞数分别为9,10,7,12；死细胞数分别为2,2,3,1.

第二个平台，四个角的活细胞数分别为11,7,9，10；死细胞数分别为3,2,2,2.

五、思考题解答与讨论

计算培养瓶中活（死）细胞数（个/ml），计算细胞存活率%。

活细胞数=（9+10+7+12+11+7+9+10）/8*10^4=93750

死细胞数=（2+2+3+1+3+2+2+2）/8*10^4=21250

细胞存活率=21250/(93750+21250)=18.48%