重组蛋白的表达
细菌的重组蛋白质表达系统
细菌的重组蛋白质表达系统蛋白质是构成生物体及细胞的重要组成部分，也是细胞功能的核心执行者。
为了研究和应用不同类型的蛋白质，科学家发展出了各种蛋白质表达系统。
其中，细菌的重组蛋白质表达系统是最常用的一种方法之一。
本文将详细介绍细菌重组蛋白质表达系统的原理、优势和应用。
一、原理细菌重组蛋白质表达系统利用细菌作为宿主来表达外源蛋白质。
这个系统主要包括以下几个重要组成部分：表达载体、宿主菌株、诱导系统和纯化方法。
1. 表达载体表达载体是指带有外源蛋白质编码序列的质粒。
这些质粒通常包括启动子、反义密码子和终止子等参与蛋白质表达的元件。
其中，启动子通过结合转录因子来启动蛋白质合成的过程。
反义密码子则能够增强蛋白质的长效稳定性，并促进其在细菌中的高效表达。
2. 宿主菌株宿主菌株在蛋白质表达系统中起到重要的作用，通常选择大肠杆菌作为宿主，主要因为大肠杆菌具有较高的生长速度、易于培养和常用的遗传工具。
此外，大肠杆菌本身产生的内切酶活性较低，有利于保护外源蛋白质的稳定性。
3. 诱导系统诱导系统是细菌重组蛋白质表达系统中的一个重要组成部分。
通常使用化学诱导或者温度诱导来启动表达载体中蛋白质编码序列的转录和翻译。
化学诱导通常通过添加一种诱导剂，如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），来激活载体中的启动子。
温度诱导则是通过改变培养温度来调节蛋白质表达。
4. 纯化方法纯化是细菌重组蛋白质表达系统中最关键的环节之一。
常用的纯化方法包括亲和纯化、碳水化合物基负载层析和凝胶过滤等。
这些方法能够根据蛋白质的特性和亲和性实现高效纯化。
二、优势与其他蛋白质表达系统相比，细菌重组蛋白质表达系统具有以下优势：1. 高效性细菌重组蛋白质表达系统是目前各种表达系统中最高效的一种方法之一。
通过优化表达条件和使用高效的诱导系统，可以实现高产量的蛋白质表达。
此外，细菌本身的生长速度也有助于高效表达。
2. 便捷性相比其他表达系统，细菌重组蛋白质表达系统的操作更为简便。
重组蛋白质的表达与纯化
重组蛋白质的表达与纯化重组蛋白质是指通过基因工程技术将目标蛋白的基因导入到宿主细胞中，使其在宿主中表达并纯化得到的蛋白质。
这项技术应用广泛，被广泛用于生物制药、医学研究以及工业生产等领域。
下面将详细介绍重组蛋白质的表达与纯化过程。
一、重组蛋白质表达过程1. 选择表达宿主重组蛋白质表达宿主的选择十分重要。
常用的表达宿主包括大肠杆菌（E. coli）、酵母（yeast）、哺乳动物细胞等。
不同的表达宿主具有不同的特点和适用范围。
例如，大肠杆菌是最常用的表达宿主之一，具有高表达水平、易操作、成本低等特点。
2.构建表达载体表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体。
常用的表达载体有质粒、病毒载体等。
质粒是最常用的表达载体，它可轻松被细菌胞内扩增，并在细胞内产生大量目标蛋白。
3.转染和表达将构建好的表达载体导入到宿主细胞中，实现转染。
转染有多种方法，如电穿孔法、化学法、微粒子轰击法等。
转染后，宿主细胞会开始表达目标基因，合成目标蛋白。
4.优化表达条件为了提高重组蛋白质的产量和纯度，需要对表达条件进行优化。
常见的优化方法包括调节培养基成分、改变培养条件、优化诱导剂浓度等。
二、重组蛋白质的纯化过程1.细胞破碎与分离表达宿主中产生的重组蛋白质往往与其他细胞组分混合在一起，需要通过细胞破碎与分离来获取目标蛋白。
细胞破碎方法包括机械法、超声法、高压法等。
分离方法包括离心、电泳、柱层析等。
2.柱层析柱层析是常用的蛋白质纯化方法之一，它基于蛋白质在柱中不同吸附剂上的亲和力差异来实现分离纯化。
常用的柱层析方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。
3.其他纯化方法除了柱层析外，还有许多其他的纯化方法可供选择。
例如，凝胶电泳、过滤、冷冻干燥等。
这些方法通常用于进一步提纯和去除杂质，以获得纯度更高的重组蛋白质。
三、重组蛋白质应用与挑战重组蛋白质的应用广泛，涉及到生物制药、医学研究、农业等领域。
例如，通过重组蛋白质技术，可以生产用于治疗疾病的药物，如人胰岛素、白介素等。
重组蛋白表达体系
目
CONTENCT
录
• 重组蛋白表达体系概述 • 重组蛋白表达体系的组成与构建 • 重组蛋白的表达方式与策略 • 重组蛋白的表达产物检测与分析 • 重组蛋白表达体系的挑战与解决方
案 • 重组蛋白表达体系的未来展望
01
重组蛋白表达体系概述
定义与重要性
定义
重组蛋白表达体系是指通过基因工程技术，将外源基因在宿主细 胞中表达并产生相应蛋白质的过程。
提高表达产物的产量与纯度
高密度培养技术
01
通过优化培养条件，提高宿主细胞的生长密度，从而提高重组
蛋白的产量。
蛋白质纯化技术
02
利用先进的蛋白质纯化技术，如亲和色谱、离子交换等，提高
重组蛋白的纯度。
蛋白质折叠与修饰
03
研究蛋白质折叠与修饰机制，优化重组蛋白的稳定性与功能。
重组蛋白表达体系在生物医药领域的应用前景
01
02
03
04
药物研发
利用重组蛋白表达体系生产具 有生物活性的药物，如单克隆 抗体、酶抑制剂等。
疫苗研发
通过表达病原体抗原或相关蛋 白，用于疫苗的研制和生产。
疾病治疗
利用重组蛋白表达体系生产具 有治疗作用的蛋白质，如生长 因子、细胞因子等。
生物材料
利用重组蛋白表达体系生产具 有特定功能的生物材料，如蛋 白质支架、纳米颗粒等。
表达产物的纯化问题
总结词
表达产物的纯化是重组蛋白表达体系中的另 一个挑战，它涉及到如何有效地分离和纯化 目标蛋白。
详细描述
表达产物的纯化问题通常与目标蛋白的溶解 性、稳定性以及与其他蛋白质的相互作用有 关。为了解决这一问题，研究人员可以采用 多种纯化方法，如离子交换、凝胶过滤、亲
重组蛋白的表达系统(详细版)
终止子：转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作用分为两类，这两类终止子均在终止点前含有一段7-20bp的回文序列。终止子可以保护mRNA在核外不被降解，显著延长mRNA的寿命，由此提高重组蛋白的表达量。但是对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率极高，宿主中随时都有充足的mRNA以供翻译，因此大部分在T7系统中表达的重组蛋白并不在意质粒上是否有终止子，只有一些自身带有翻译起始信号的外源基因需要终止子。启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真核宿主）的类型选择不同的启动子以便于目的基因的高效表达。
表4：常用原核表达载体质粒
1.3 优化表达条件
重组蛋白的表达流程很少有一次成形的，为了提高蛋白表达量、改善蛋白质量，表达条件和白不表达时：
2
如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有），首先检查cDNA和质粒是否正确，蛋白对宿主菌是否有很大毒性，然后尝试更换菌株、质粒载体和融合标签。原核蛋白在大肠杆菌中不能表达的情况很少见，通常是真核蛋白不能表达。不能表达的重组蛋白，即使在更换了宿主、载体后可以表达，表达量也不会很高，如果需要大规模生产，最好尝试酵母和昆虫细胞表达系统。
融合标签：融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用的重组标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也不必引入标签。融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒，如pET、pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选，应根据蛋白具体情况进行选择。His-tag是最常用的纯化标签，它具有很多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（pH8.0），免疫原性差，通常不影响重组蛋白的结构和功能，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达到60%-90%的纯度。如果蛋白质溶解度不高，导致折叠困难、表达量低，可以选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx等）帮助重组蛋白表达和折叠，提高重组蛋白溶解度，从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困难甚至提前中止，纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白产率和后续纯化，所以在短标签能够达到目的的时候，尽量不要选择大的融合标签。标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，可以帮助目的蛋白表达，提高表达量，但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，降低重组蛋白纯度，对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签；C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区，如酶活中心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免影响重组蛋白的结构和功能。如果融合标签对蛋白性质有较大影响，但又是纯化所必须的，就可以考虑在纯化过程中去除标签。主要有三种方法：化学裂解，如溴化氰（CNBr）、羟胺（NH2OH）等，能够简单有效地去除标签，但反应条件苛刻（羟胺需要在pH9.0下反应），特异性较差，而且会引入不必要的修饰，除包含体蛋白的处理外已经很少使用了；酶解，如PPase等，其底物一般是一段比较长的肽链，特异性强，是目前比较常用的方法，缺点是酶切反应需要较长的时间，也增加了蛋白纯化的步骤，使纯化变得繁琐；IMPACT质粒，该质粒在纯化标签和目的蛋白之间插入了一个蛋白质内含子（intein），intein具有可诱导的自切割活性，使用IMPACT质粒表达的重组蛋白，只需要改变缓冲液的pH和温度，即可切掉融合标签。
重组蛋白诱导表达方法
重组蛋白诱导表达方法一、基因克隆和表达载体构建基因克隆是重组蛋白诱导表达的第一步，包括基因的获取、基因的剪切和拼接等步骤。
在获取基因时，可以通过基因文库筛选、PCR 扩增、人工合成等方法。
剪切和拼接基因时，需要选择合适的限制性内切酶和连接酶，以确保基因的准确拼接。
表达载体的构建是将克隆的基因插入到载体中，以使基因在宿主细胞中表达。
常见的载体包括质粒、噬菌体、病毒等，根据基因的大小和表达需求选择合适的载体。
二、宿主菌的选择和转化宿主菌是用于表达重组蛋白的微生物细胞，根据基因的表达需求选择适合的宿主菌。
将构建好的表达载体导入宿主菌中，使基因在宿主菌中表达。
转化方法包括电转化、化学转化、显微注射等。
三、重组蛋白的表达诱导将转化后的宿主菌进行培养，在适当的温度、pH、营养等条件下，诱导重组蛋白的表达。
根据不同的宿主菌和载体，选择合适的诱导剂和诱导条件。
四、重组蛋白的分离和纯化重组蛋白在宿主菌中表达后，需要进行分离和纯化，以获得高纯度的蛋白质。
分离和纯化方法包括离心、沉淀、过滤、离子交换、亲和层析等。
五、重组蛋白的检测和鉴定通过电泳、免疫学、质谱等技术对重组蛋白进行检测和鉴定，以确定蛋白质的分子量、等电点、抗原性等性质。
六、重组蛋白的应用和功能研究重组蛋白具有广泛的应用价值，可用于制备抗体、研究蛋白质的结构和功能、开发新药等。
同时，通过对其功能的研究，可以深入了解蛋白质的作用机制和生物学过程。
七、重组蛋白的表达优化为了提高重组蛋白的表达量和纯度，需要进行表达优化。
包括选择适合的宿主菌和载体、调整培养条件、优化诱导条件等。
同时，可以通过蛋白质工程手段对蛋白质进行改造，以提高其表达量和稳定性。
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程通常包括以下步骤：
1. 克隆：首先需要将目标基因克隆到适当的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后将其与表达载体连接，形成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒转化到大肠杆菌细胞中。
可以使用化学方法（如热冲击法）或电穿孔法将质粒导入细胞。
3. 选择：转化后，将细胞分散在含有适当抗生素的琼脂平板上培养。
只有带有重组质粒的细胞能够存活并形成菌落。
4. 培养：将含有重组细胞的培养液转移到适当的培养基中，并在适当的条件下培养。
这可能包括调节温度、pH值和搅拌速度等。
5. 表达：在培养期间，目标基因会被大肠杆菌细胞转录和翻译为蛋白质。
使用适当的启动子和调控序列，可实现目标蛋白的高效表达。
6. 细胞破碎：一旦细胞达到最佳表达水平，就需要破碎细胞以释放目标蛋白。
这可以通过多种方法实现，如超声波、高压破碎或化学方法。
7. 纯化：通过使用各种分离和纯化技术（如亲和层析、凝胶过滤、离子交换层析等），从细胞裂解液中纯化目标蛋白。
以上是在大肠杆菌中表达重组蛋白的一般流程。
具体的步骤和条件可能因实验设计和目标蛋白的特性而有所不同。
大肠杆菌重组蛋白表达流程
大肠杆菌重组蛋白表达流程大肠杆菌重组蛋白表达流程主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达载体：通常选择含有启动子、转录终止子、选择标记和适当的表达调控元件的表达载体。
启动子用于驱动基因转录，转录终止子用于确定转录产物的结束位置，选择标记有助于筛选含有目的基因的转化子，而表达调控元件可以调节基因的表达水平。
2. 构建表达载体：将目的基因插入表达载体中，构建成重组表达载体。
在此过程中，需要考虑目的基因的orientation（方向）、阅读框（ORF）以及表达调控元件的活性等因素。
3. 转化大肠杆菌：将构建好的重组表达载体转化到大肠杆菌中。
转化方法有多种，如化学法（如CaCl2法）、电转化、热激转化等。
转化后，大肠杆菌吸收了外源DNA，成为重组菌株。
4. 筛选重组菌株：在含有选择性抗生素的培养基上培养转化后的菌落，筛选出含有目的基因的重组菌株。
此外，可以通过鉴定菌落的形态、颜色等特征进行初步筛选。
5. 诱导表达：将筛选出的重组菌株接种到含有诱导剂（如IPTG）的培养基中，诱导目的基因的表达。
诱导剂IPTG可以与表达载体中的启动子结合，增强基因转录和翻译的效率。
6. 收集和纯化重组蛋白：诱导表达后，菌体中会含有目的蛋白。
可以通过离心、破碎细胞、柱层析等方法分离和纯化重组蛋白。
常用的纯化标签有His标签、GST标签等，这些标签可以帮助分离和纯化目的蛋白。
7. 蛋白活性检测和应用：对纯化的重组蛋白进行活性检测，如酶活测定、蛋白互作实验等。
确认蛋白活性后，可应用于生物学研究、药物研发等领域。
需要注意的是，大肠杆菌重组蛋白表达过程中可能会遇到表达量低、蛋白包涵体等问题。
为了解决这些问题，可以尝试优化表达载体、改变诱导条件、使用融合标签等策略。
重组蛋白质的表达纯化和结构鉴定
重组蛋白质的表达纯化和结构鉴定在生物医学领域中，重组蛋白质凭借其广泛的应用前景成为了研究热点。
然而，要想获得高纯度的重组蛋白质，并对其结构进行准确的鉴定，需要经历一系列复杂而细致的实验步骤。
本文将从表达、纯化和结构鉴定三个方面介绍重组蛋白质的研究过程。
一、表达重组蛋白质的表达是研究重组蛋白质最初的关键步骤之一。
通常采用大肠杆菌（Escherichia coli）作为表达宿主。
首先，需要将目标基因克隆至表达载体中，确保其与启动子、转录因子等相互配合，并携带一定的标签，如His 标签、GST 标签等。
接着，将修饰好的表达载体转化至大肠杆菌中，采用选择性培养基筛选出目标菌株。
最后，将筛选得到的菌株进行大规模培养，促使目标基因在细胞内表达。
二、纯化获得表达目标蛋白的菌株后，需要将蛋白从细胞中纯化出来。
首先，采用超声波或高压颠破细胞壁，释放出蛋白质。
接着，通过离心等手段将蛋白质与其他细胞组分分离。
此时，可以利用目标蛋白质特异性的亲和层析柱，如镍柱、葡聚糖柱等，吸附目标蛋白质，并通过逆向洗脱等方法，得到高纯度的目标蛋白质。
三、结构鉴定获得纯度较高的重组蛋白质后，需要对其结构进行进一步的鉴定。
常用的结构鉴定方法包括X射线晶体学、核磁共振（NMR）、电子显微镜等。
X射线晶体学是目前应用最广泛的方法，通过将蛋白质结晶并进行X射线衍射实验，得到蛋白质的高分辨率结构。
NMR则通过测量蛋白质中核自旋的相对位置和相互作用关系，获取蛋白质的三维结构信息。
电子显微镜是一种能够获得蛋白质高分辨率结构的技术，主要应用于研究大分子复合物和纤维形态的蛋白质。
除了上述常用技术外，近年来还涌现出一些新的结构鉴定方法，如质谱联用技术、光学显微镜成像、负染电镜等。
这些方法的出现，为蛋白质结构鉴定提供了更多的选择和便利。
由于篇幅所限，本文仅对重组蛋白质的表达、纯化和结构鉴定进行了简要介绍。
事实上，研究重组蛋白质的过程还包括目标基因的设计与合成、蛋白质的功能分析等环节。
重组蛋白质的表达与纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分，对于生命体的生长、繁殖和免疫功能起着至关重要的作用。
而重组蛋白质则是利用基因工程技术，将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中，通过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。
这种技术不仅可以生产天然蛋白质，还可以生产人工合成的新型蛋白质，对于疾病的治疗和新药的研发有着重要的意义。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。
选择适当的宿主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点，广泛应用于重组蛋白质的表达和纯化。
其表达载体主要有pET和pBAD两种，pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白，pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。
2.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系，常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。
昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质，如糖蛋白、膜蛋白等。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。
其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等，常用于表达与人体有关的蛋白质，如抗体、生长因子等。
二、蛋白质纯化技术蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节，其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。
常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。
1.亲和层析法亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。
亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物，如亲和标签、酶底物、抗体等。
常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。
2.离子交换层析法离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。
离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂，其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
基因工程的下游技术重组蛋白的表达、纯化和分析
基因工程的下游技术是实现基因功能研究和基因产品开发的关键环节，对于生 命科学研究、生物医药、农业、工业等领域具有重要意义。
基因工程下游技术的分类与流程
01
02
03
04
05
分类
1. 目的基因的克 2. 重组载体转化 3. 表达产物的分 4. 表达产物的分
隆和…
宿主…
离和…
析
基因工程下游技术主要包 括重组蛋白的表达、纯化 和分析等技术。
根据宿主细胞的偏好性， 对重组蛋白基因的密码子 进行优化，以提高重组蛋 白的表达水平。
载体优化
通过改造载体，增加重组 蛋白的表达量和稳定性， 如使用分泌型载体、融合 标签等。
培养条件优化
通过调整培养基成分、温 度、pH等培养条件，提高 重组蛋白的表达水平。
03 重组蛋白的纯化
重组蛋白的分离与纯化方法
详细描述
纯化是重组蛋白制备的关键步骤，通常采用多种分离纯化技术，如离心、过滤、沉淀、离子交换、亲和层析等， 以去除杂质并获得高纯度的目的蛋白。
案例二：重组蛋白的结构与功能分析
• 总结词：重组蛋白的结构与功能分析是了解蛋白性质和功能的重要手段，通过 X射线晶体学、核磁共振等技术，可以解析蛋白质的三维结构，进一步揭示其 生物学功能。
重组蛋白纯化的优化策略
选择合适的亲和配基
针对目的蛋白的特性选择特异性结合的配基，提高亲和 色谱的纯度。
结合多种分离方法
综合运用多种分离技术，如凝胶过滤色谱和反相色谱等 ，提高目的蛋白的纯度和回收率。
ABCD
优化离子交换色谱条件
通过调整离子强度、pH等参数，提高分辨率和纯度。
优化缓冲液和添加剂
选择合适的缓冲液和添加剂，如稳定剂、还原剂等，保 持目的蛋白的稳定性和活性。
蛋白质重组表达技术
蛋白质重组表达技术
蛋白质重组表达技术是一种利用基因工程技术将编码目的蛋白质的基因插入宿主细胞中，实现重组蛋白质的表达、纯化和应用的技术。
该技术主要涉及以下步骤：
1.目的基因的获取：根据需求设计合成或从天然基因库中提取目的基因。
2.构建基因表达载体：将目的基因插入到表达载体中，形成重组质粒。
表达载体可以是原核或真核生物的质粒或病毒载体。
3.转化或转染宿主细胞：将重组质粒导入宿主细胞中，常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等。
转化或转染的方法包括化学法、电穿孔法、噬菌体感染等。
4.重组蛋白质的表达：宿主细胞接受重组质粒后，开始表达目的蛋白质。
表达形式可以是细胞内或细胞外表达，具体取决于目的蛋白质的性质和宿主细胞类型。
5.蛋白质的纯化和鉴定：通过各种纯化技术，如离心、过滤、离子交换、亲和层析等，将重组蛋白质从宿主细胞中分离出来，并进行性质鉴定，包括SDS-PAGE、Westernblot、质谱等技术。
6.蛋白质的功能研究和应用：对重组蛋白质进行生物化学性质和功能的研究，发掘其在医药、农业、工业等领域的应用价值。
总之，蛋白质重组表达技术是现代生物技术领域中非常重要的技术平台之一，可应用于新药研发、疫苗生产、生物材料制备等多个领域。
重组蛋白的表达
重组蛋白的表达1.概述分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）时期，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面阻碍到下游的分离纯化，因此在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的阻碍，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。
目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著阻碍下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依靠于所选择的表达系统。
选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间能够幸免破裂细胞的步骤，同时由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对集合的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的阻碍，关于其中的有些缺点能够通过一定的方法进行克服和幸免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能爱护目标蛋白不被降解（96）。
表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点表达策略优点缺点分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成降低蛋白酶对表达蛋白的降解可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化不需要细胞破裂表达水平低多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的开释周质空间蛋白的技术周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解胞内包涵体表达包涵体易于分离爱护蛋白质不被降解蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的阻碍，通常可获得高的表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠一样具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。
重组蛋白的高效表达及纯化技术研究
重组蛋白的高效表达及纯化技术研究随着生物技术的发展，蛋白表达与纯化技术在医疗、工业以及科学研究等领域中扮演着越来越重要的角色。
其中，重组蛋白的高效表达及纯化技术是蛋白质学研究的关键环节之一。
本文旨在探讨目前被广泛应用的几种重组蛋白表达及纯化技术，以及它们的新进展与应用前景。
一、背景介绍重组蛋白指的是通过基因重组技术将人工合成的DNA片段引导到细胞中，使其在受到特定刺激后大量表达特定功能蛋白的一种新型蛋白质。
由于其具有高度专一性、易制备性以及更高的效力和安全性，越来越多的药物被开发为基于重组蛋白的生物制剂。
二、重组蛋白表达技术1. 原核表达系统原核表达系统是将DNA片段导入大肠杆菌等细菌中，在其形成菌落的过程中进行表达。
该系统的优点在于表达速度快、操作简便、表达产量高。
但同时，由于原核表达与真核细胞中的表达相比，它对于蛋白翻译辅助因子和蛋白修饰等生物特征的模拟程度较差，不利于蛋白的正确折叠，因此该系统表达的蛋白质通常需要经过重新折叠处理。
2. 原核表达系统与原核表达系统相比，真核表达系统更接近真实情况中的表达方式，对于全长的蛋白大多数时候能够实现正确的折叠。
在真核表达系统中，常用的系统包括昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌表达系统等。
其中，哺乳动物细胞表达系统能够实现高产量、高质量的蛋白质表达，因此被广泛应用于蛋白质制备。
三、重组蛋白纯化技术1. 亲和层析法亲和层析法是一种将目标蛋白质从混合物中分离出来的技术。
该技术的依据是一种特定的与目标蛋白质具有相互作用的配体分离柱。
在该技术中，目标蛋白质与配体分离柱上的特定功能团结合，非特异性的蛋白质能够在洗脱过程中被去除。
2. 总体分离法总体分离法是将目标蛋白从混合物中分离出来，采用离心、可溶性和非可溶性的分离方法。
其中，在采用可溶性分离的方式时，常用的方法有两相法、分配层析等。
四、新兴技术及应用前景近年来，3D打印技术的应用逐渐渗透到生物医疗领域，并开始用于制备组织工程器官和人造蛋白质等领域。
重组蛋白的表达与纯化技术研究
重组蛋白的表达与纯化技术研究随着基因工程和生物技术的发展，重组蛋白的表达及纯化技术在生物医药领域得到了广泛应用。
重组蛋白是通过将目标基因转移到宿主表达系统中，利用宿主细胞表达并合成特定蛋白的技术。
表达后的蛋白需要经过纯化、鉴定和活性分析，以确保获得高纯度和高活性的蛋白。
本文将介绍重组蛋白的表达与纯化技术研究的相关内容。
重组蛋白表达技术是通过将目标基因克隆到表达载体中，然后将表达载体转入宿主细胞中进行表达。
常用的表达系统包括大肠杆菌、酿酒酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
在选择表达载体时，需要考虑载体的复制数、启动子的强度和宿主细胞的适应性。
而在选择宿主细胞时，需要考虑宿主细胞的生长特性、表达能力以及宿主细胞的酶切位点等因素。
表达载体和宿主细胞的选择将直接影响重组蛋白的表达水平和纯化效果。
在重组蛋白的表达过程中，除了选择适合的表达系统外，还需要优化培养条件和表达工艺。
培养基的组成、培养温度、培养时间、诱导条件等因素都会影响蛋白的表达水平和纯度。
常见的优化方法包括调整培养基的成分、优化培养条件和诱导条件、构建工程菌株以及使用辅助因子等。
通过合理的优化，可以提高蛋白的表达水平和纯度，为后续的纯化工作奠定基础。
重组蛋白的纯化是确保蛋白质高纯度和高活性的关键步骤。
常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、逆流色谱和层流洗脱等技术。
亲和层析是通过目标蛋白与特异性结合剂之间的亲和力选择性地捕获目标蛋白。
离子交换层析是利用蛋白质与带电离子交换剂间的相互作用进行纯化。
凝胶过滤层析则是根据蛋白分子大小进行分离纯化。
逆流色谱和层流洗脱则是利用目标蛋白与静电荷间的相互作用进行分离。
通过合理选择和组合这些方法，可以获得高纯度和高活性的重组蛋白。
在纯化过程中，还需要进行蛋白质的结构鉴定和活性分析。
结构鉴定可以通过质谱分析、核磁共振、X射线晶体学等技术来实现。
活性分析则是通过特定的活性测定方法来验证蛋白的功能和活性。
重组蛋白诱导表达的原理
重组蛋白诱导表达的原理
重组蛋白诱导表达技术是研究的重要手段，用于发掘目标蛋白质，表达，并验证它的生理作用。
重组蛋白诱导表达技术，也称重组蛋白表达，是基于当前分子生物学过程的一类新兴技术，它利用基因工程原理重新构建出指定的质粒，依据基因组结构，使之不断发挥交互作用，以表达相应的蛋白质，从而实现蛋白质的精准调控。
早期，重组蛋白表达技术主要采用噬菌体来介导表达，但随着质粒的生物学改造技术的阐述及研究，其他类型的质粒，如嗜热菌嗜热表达系统，也被研制出来，以解决细菌抗性问题及噪声表达的假阳性问题。
此外，构造不同序列结构形式的重组蛋白表达载体，利用现代分子生物学技术已成功构建出细菌、酵母菌、哺乳动物疫苗表达系统，具有良好的重组蛋白表达性能，可大幅度提高重组蛋白表达水平，在研究蛋白质相互作用及生物转录中发挥重要作用。
控制蛋白质表达通常靠调控元件的表达水平，其中，启动子和终止子的表达为重要，质粒形式的构造可以有效提升重组蛋白的表达能力，不仅可以控制重组蛋白表达的量级，并且可以控制重组蛋白在特定细胞株或细胞类型中的表达。
研究表明，具有正确的调控起始点或其他模板序列的表达载体，可以增加表达产物的高水平与持久的表达。
综上所述，重组蛋白诱导表达技术是一种多功能的，灵活的技术，可以有效实现精准调控重组蛋白的表达水平。
这种技术的发展，不仅使研究者能够更为精细地解析特定蛋白质的生物功能，而且还有可能促进相关药物开发与应用，以创造更有效的治疗方案。
重组蛋白的表达与分离纯化
基因工程重组蛋白的表达与分离纯化实验目的：1.了解基因工程重组表达载体的构建和筛选方法；2.掌握重组蛋白诱导表达的机理；3.掌握蛋白的分离纯化方法，并学会使用SDS-蛋白质凝胶电泳；实验原理：将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30表达载体中，让其在E.coli中表达。
先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。
然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。
表达蛋白可经SDS-PAGE检测。
实验器材：1.仪器：高速冷冻离心机、恒温培养箱、高压灭菌锅、SDS-凝胶电泳仪、水浴锅、抽滤装置、AKTA液相色谱仪等；2.材料：LB培养基、溶菌酶、缓冲液A和B、氨苄青霉素、IPTG诱导剂、10%SDS等；实验内容：1.灭菌：①配置LB培养基20 ml*2 +100 ml*6(配方：酵母粉 0.5%，NaCl 1%，胰蛋白胨1%)；②黄、蓝枪头各一盒；2.菌体活化及扩培：①每瓶20 ml LB培养基中加入20 ul Amp后，再加入30~40 ul DH5α菌液，置于37℃恒温箱内，培养12~16 h；②活化后，在六瓶100 ml LB培养基中分别加入100 ul Amp后，再从20 ml活化后的菌液中取2 ml，置于37℃恒温箱内扩大培养，至少培养2.5 h以后加入IPTG 200ul，37℃，培养14~16h；3.细胞破碎及蛋白分离：①将菌液用大离心管收集，配平后，4000r/min，离心15 min，收集菌体；②用20 ml BufferA重悬菌体，4000r/min，再离心15 min，收集菌体；③用4 ml BufferA重悬菌体，加入溶菌酶40 ul混匀，静置15min；④再加入4 ml BufferB，混匀，75℃水浴保温1 h；⑤用高速冷冻离心机在4℃的条件下，8000r/min，离心20 min，收集上清液；⑥将上清液分装入几个浓缩管中，4℃，3000r/min浓缩一段时间至终体积为5-10ml，做好标记，备用；⑦实验过程中，配置五种AKTA液相色谱仪所需液体，并抽滤2遍；4.AKTA液相色谱分析及SDS凝胶电泳：①首先学习AKTA仪器的相关使用方法和注意事项，对仪器进行排气，平衡缓冲液冲洗等操作(该部分由老师操作演示)；②取5 ml浓缩后的液体过滤后上样，观察屏幕上紫外吸收曲线的变化，适时用离心管收集每个峰的样品，做好标号，备用。
重组蛋白的表达载体和表达方式
什么是重组蛋白？
重组蛋白（recombinant protein）是指应用重组 DNA 或重组 RNA 技术而获得的蛋白质。
重组蛋白工程先应用基因克隆或化学合成技术获得目的基因（gene of interest，GOI），连接到适合的表达载体，导入到特定的宿主细胞，利用宿主细胞的遗传系统，表达出有功能的蛋白质分子。
什么是表达载体？
表达载体（expression vector）是一种可以携带外源基因并在宿主细胞中进行表达的工具，它通常是一种质粒或病毒。
表达载体除了包含外源基因外，还需要包含一些必要的元件，如启动子、终止子、选择标记、筛选标记等。
重组蛋白的表达方式有哪些？
按重组蛋白的表达方式，表达载体大致可分为以下几种：
•单独表达：指目的基因单独编码一个蛋白质，在宿主细胞中以自由形式存在。
这种方式适用于大多数不需要翻译后修饰或结构域相互作用的蛋白质。
•融合表达：指目的基因与其他基因（如伴侣蛋白、纯化标签等）相连接，编码一个含有多个功能区域的融合蛋白，在宿主细胞中
以结合形式存在。
这种方式可以增加目的蛋白的溶解度、稳定性、纯化效率和活性检测等。
•分泌表达：指目的基因与一个信号肽基因相连接，编码一个含有信号肽的前体蛋白，在宿主细胞中经过分泌途径被运输到胞外或胞器内。
这种方式可以避免目的蛋白在胞质中形成包涵体或受到降解酶的作用，也可以实现一些翻译后修饰，如糖基化等。
基因工程的下游技术重组蛋白的表达、纯化和分析
2. 亲和层析柱的安装 把层析柱固定在铁支架上，柱下端出 口封闭。加入少量的无离子水，排去下端 的空气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶 4mL到烧杯中，加入少量的无离子水制成 糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝 胶倒进柱内，打开下端的排水口，让亲和 凝胶剂随水流自然沉下。亲和层析剂为 45mL。
3. 1#：接50μL空载工程菌（含pUC18）过夜培 养物，25-28℃培养10 h-12h； 2# ：接 50μL 重组菌（含 pGFPuv ）过夜培养 物，25-28℃培养10 h-12h； 3#：接50μL重组菌（含pGFPuv ）过夜培养 物， 37℃培养至 O.D600 约为 0.5 （约 3h-4h) ， 然后加入20%葡萄糖50μL至终浓度为0.2%， 及100mM IPTG 5μL至终浓度为0.1mM，2528℃培养8h-10h或过夜； 6#：接500μL重组菌（含pGFPuv）过夜培养 物， 37℃培养至 O.D600 约为 0.5 （约 3h-4h) ， 然后只加入 100mM IPTG 50μL 至终浓度为 0.1 mM，25-28℃培养8h-10h或过夜。
一．实验目的 了解和掌握IPTG诱导表达的原理。 了解降解物阻遏的现象及其机理。
二．实验原理
操纵子是基因表达的协调单位。通常由2 个以上功能相关的结构基因以及一些调节 序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。
乳糖操纵子由三个结构基因 Z 、 Y 、 A 和 操纵序列、启动子、 CAP 结合位点等调 节序列组成。
四．实验仪器
超净工作台、 恒温摇床、离心机等。
五．操作步骤 1. 挑取含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质 粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉 （终浓度为100μg/mL，以下同)的5mL的 LB培养基中，于37℃、250rpm过夜培养 12h-14h至对数生长期。 2. 取 3 支已灭菌的大试管，分别加入 5mL 含 有氨苄青霉素的 LB 培养液，编号为 1# ， 2#，3#，另取一个250mL的灭菌三角瓶， 编号为6#，加入50mL含氨苄青霉素的 LB 培养液。
重组蛋白表达和表征
重组蛋白表达和表征重组蛋白表达和表征随着现代生物技术的发展，重组蛋白技术已经成为了生物学和医学领域的重要研究工具。
通过表达目标蛋白，可以用于研究特定蛋白的结构、功能和作用机制等方面。
本文将着重介绍重组蛋白表达和表征的相关知识。
一、重组蛋白表达重组蛋白表达是指利用现代生物技术手段，将目标蛋白基因克隆入载体并表达出来的过程。
在这个过程中，需要选择一个适合的表达载体并将目标基因插入其中，然后通过合适的表达条件，使得目标蛋白在细胞中得到充分表达。
一般情况下，表达载体可以是大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等不同的表达宿主。
1. 选择表达载体选择适合的表达载体是重组蛋白表达的关键。
不同的表达宿主具有不同的优点和不足。
例如，大肠杆菌表达系统具有高效和简单的操作特点，但是在表达复杂蛋白时容易出现折叠和溶解问题；哺乳动物细胞表达可以在分泌型和细胞内型进行，但是由于表达时间周期长，表达量低等原因，通常用于大规模生产。
2. 克隆目标基因在选定适合的表达载体后，需要将目标基因克隆到载体中。
一般有PCR 扩增、限制性内切酶切割等方法实现。
此外，还需要选择合适的启动子、选择子、标签等元素，以便完成高效稳定的表达。
3. 利用不同表达系统实现重组蛋白表达具体地，可以使用原核表达体系、酵母表达体系、哺乳细胞表达体系及昆虫表达体系等实现重组蛋白表达。
其中，原核表达体系中最常用的是大肠杆菌，酵母表达体系中最常用的是毕赤酵母，而哺乳细胞表达体系中最常用的则是CHO细胞等。
二、重组蛋白表征重组蛋白表征是指对已经表达出来的重组蛋白进行检测、纯化、鉴定等过程。
这个过程中需要采用多种手段，如SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot检测、质谱分析、生物活性检测等。
1. SDS-PAGE蛋白电泳SDS-PAGE蛋白电泳是常用的蛋白质分析方法，可以用来确定蛋白分子量、纯度等，以及检查蛋白的电泳性质等。
通过对目标蛋白的去氧核糖核酸和蛋白质的标记，可以检测到蛋白质的表达和纯化情况。
重组蛋白的表达系统
添加 标题
昆虫细胞表达系统：以Sf9和Bm5细胞为代表优点是 能够进行真核翻译后修饰表达的蛋白具有生物活性； 缺点是操作较为复杂且表达量有限。
添加 标题
哺乳动物细胞表达系统：以CHO和HEK293为代表 优点是能够高度模拟真核生物的翻译后修饰表达的蛋 白具有高度生物学活性；缺点是操作复杂成本高且表 达量有限。
宿主细胞的选择与培养
宿主细胞的选择：根据重组蛋白的特性选择适合的宿主细胞如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺 乳动物细胞等。
宿主细胞的培育：通过培养基和生长条件的优化提高宿主细胞的生长速率和蛋白表达水平。
宿主细胞的遗传改造：通过基因敲除、基因沉默等技术手段对宿主细胞进行遗传改造以实现重 组蛋白的高效表达。
重组蛋白表达系统的分类
添加 标题
原核表达系统：以大肠杆菌为代表优点是操作简便、 成本低适用于大规模生产；缺点是表达的蛋白缺乏真 核生物特有的翻译后修饰且表达量不稳定。
添加 标题
酵母表达系统：以酿酒酵母和毕赤酵母为代表优点是 能够进行真核翻译后修饰表达的蛋白具有生物活性； 缺点是表达量相对较低且产物大多为包涵体。
宿主细胞的反应条件：通过调节温度、pH、营养物质等反应条件实现对重组蛋白表达过程的精 细控制。
重组蛋白的表达诱导与检测
诱导方法：使用诱导剂诱导目的基因的表达 检测方法：通过免疫印迹法、荧光检测等技术检测目的蛋白的表达情况 目的：验证重组蛋白表达系统的可行性 意义：为进一步研究重组蛋白的结构和功能奠定基础
重组蛋白表达系统的改进方向
优化宿主细胞：选择更合适的宿主细胞以提高重组蛋白的表达水平和产量。 基因工程改造：通过基因工程手段对重组蛋白进行改造以提高其表达效率和稳定性。 添加分子伴侣：利用分子伴侣的作用提高重组蛋白的折叠效率和分泌能力。 开发新型表达系统：不断探索和开发新型的表达系统以克服现有表达系统的限制和不足。
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重组蛋白的概述1.概述分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。
目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。
选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。
表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点表达策略优点缺点分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成降低蛋白酶对表达蛋白的降解可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化不需要细胞破碎表达水平低多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解胞内包涵体表达包涵体易于分离保护蛋白质不被降解蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的影响，通常可获得高的表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。
在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。
所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。
当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。
蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。
除了在分离纯化的初期，要采用快速的方法除去影响目标蛋白稳定性的杂质，还要严格控制涉及蛋白质变性的各种因素，来避免蛋白质失去活性。
蛋白质的构象稳定性可以通过测定蛋白质变性反应时折叠（f）和去折叠（u）间自由能的变化（ΔG f→u）来衡量，ΔG f→u越大蛋白质就越稳定。
根据报导蛋白质的ΔG f→u在5—20kcal/mol范围之间，单个氢键可造成0.5—2kcal/mol自由能的变化，一个离子对可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的变化，因此ΔG f→u相对比较小，这样天然状态仅仅比去折叠状态稳定一点，所以必须克服蛋白质内在的不稳定性，保留蛋白的活性。
这一点在分离纯化和蛋白质储存中都很重要，影响蛋白质稳定性的因素有温度、pH、离子强度、某些添加剂、表面吸附、震摇、剪切力、冻融、蛋白浓度、压力等，这些因素对折叠的影响有的是可逆的，有的是不可逆的，而且相互之间也有影响，在实际处理中应选择合适的条件，尽量避免不利因素的影响（2），并利用活性跟踪的方法对处理进行评价，指导分离纯化。
在进行任何纯化工作时，第一步必须针对目标蛋白建立特异性的分析方法。
这些特异性的分析方法都是基于目标蛋白的一些特性，如酶的活性，免疫学活性，物理特性（如分子量、等电点、光谱学特征等），生物学活性。
在理想的情况下，我们希望所选择的分析方法具有特异、快速、灵敏和可定量的特点。
特异性要求分析方法反映目标蛋白的独特性，以排除假阳性。
快速则要求能很快的给出定性和定量结果，以便更好的与分离纯化的工作相衔接。
灵敏的分析方法仅需要少量的样品，这就给操作带来了极大的方便。
在分离纯化的每一步，都需要对蛋白和活性进行定量，这就要求分析方法有准确可定量的特点，以对分离纯化的效果进行评价。
如通过SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子量来鉴定蛋白质，由于电泳的分辨率限制，常常不能确定收集部位中是否含有目标蛋白或目标蛋白是否得到了富集，这时就需要运用更特异的分析方法，如Western blotting 就可以从复杂的混合物中描述蛋白的分子量，并对蛋白进行定量。
另外当一些蛋白没有方便可用的生物学活性测定方法，或者由于干扰物质的存在不能测活，可应用一些免疫学的方法进行检测。
在纯化的过程中，需要监测以下几个参数：总的样品体积，样品中总的蛋白，目标蛋白的活性单位，通过这些基本的信息，就可以跟踪每步纯化的效率，计算出目标蛋白的回收率，目标蛋白的比活性，以及纯化的倍数，从而对纯化的每一步，乃至整个流程进行定量评价。
Richard等在纯化重组大肠杆菌RNA聚合酶σ32亚基的工作中给出了很好的范例，在定量测定项中，包括了蛋白质的定量测定、定量SDS-PAGE、定量蛋白质斑点印迹和酶活测定，使用这些方法对操作的每一个阶段取样进行纯化效果的评价，从而确保每一步纯化的有效性（1）。
正是由于分析方法在分离纯化中的指导性作用，所以有效的分析方法是分离纯化是否能够成功的前提。
重组蛋白表达纯化的基本策略的具体步骤最终取决于样品的性质。
但也有共同可参考的阶段捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。
中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。
精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。
分离方法的选择根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。
分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。
总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。
处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。
如上样体积、浓度等。
速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。
回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。
在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技主要特点捕获 中度纯精制 样品起始状样品最终状蛋白质的性质方法 特异性结合亲和（AC ）RPC 高分辨率★★★★需要有机溶剂在有机溶剂中，有损失生物活性的风险1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。
第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。
2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。
3、GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。
4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。
6、只要目标蛋白耐受的情况下，可以考虑采用RPC方法用于精制阶段。
注：应该指出，三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。
所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。
1.分离纯化的方法策略及其应用下游的分离纯化步骤不仅要在可替换的分离技术间进行选择，如细胞的破碎可选择高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎或酶溶法，分离细胞、细胞碎片、包涵体和沉淀物，可选择离心或过滤，需要进行浓缩的时候，可选择沉淀或超滤；另一方面，设计的纯化工艺包括特定的层析步骤，及层析的先后顺序，以期得到最大的得率。
吸附层析，如离子交换层析，疏水层析和亲和层析，可基于特定的选择性达到对目标蛋白的纯化，适用于大量样品的处理。
凝胶过滤层析用于后续的精制步骤，如去除少量的杂蛋白或聚合体，在纯化过程中用于脱盐和缓冲液交换。
在分离纯化中对每个步骤的选择，可以遵循以下原则：1 应尽可能的利用蛋白质的不同物理特性选择所用的分离纯化技术，而不是利用相同的技术进行多次纯化；2不同的蛋白质在性质上有很大的不同，这是能从复杂的混合物中纯化出目标蛋白的依据，每一步纯化步骤应当充分利用目标蛋白和杂质成分物理性质的差异。
所以在分离纯化的开始阶段，要尽可能的了解目标蛋白的特性，不仅如此还要了解所存在杂质成分的性质，如大肠杆菌的蛋白大多是一些低分子量的蛋白（<50000Da），而且酸性蛋白较多；3 在纯化的早期阶段要尽量减少处理的体积，方便后续的纯化；4 在纯化的后期阶段，再使用造价高的纯化方法，这是因为处理的量和杂质的量都已减少，有利于昂贵纯化材料的重复使用，减少再生的复杂性（84）。
在下游的纯化工艺中为了提高蛋白的得率和处理的效率，应当使用最少的纯化步骤，经典的纯化过程如图1 所示。
在初始的纯化阶段，除了使目标蛋白和细胞内的DNA、RNA、多糖以及性质差别较大的蛋白质成分分离，采用的分离方法要能除去影响目标蛋白稳定性的杂质，保护目标蛋白不被蛋白酶降解，进行目标蛋白的捕获和浓缩。
在这一阶段的纯化中，盐析沉淀仍然应用，但共沉淀的杂质常常很多，离子交换层析和疏水层析具有操作上的优点，可以再生使用，成为这一步通常选用的层析方法；中间阶段纯化是最为关键的阶段，这时要能达到和大量的杂蛋白分离，利用蛋白质不同的性质选择不同的纯化方法，每一步的方法要有足够的选择性，提高目标蛋白质的纯度；最后进行精制纯化，常用凝胶层析，使目标蛋白的纯度进一步提高达到要求。
对于包涵体蛋白质，由于涉及包涵体蛋白质的变复性，其纯化步骤和方法与可溶性蛋白不同，需要对每一种包涵体蛋白质建立相应的复性方法，将在后面作介绍。
图1 经典的蛋白质纯化流程图在工业上，为了尽可能提高过程的通量和减少生产的成本，发展的方法与传统的方法不同。
双水相萃取和扩张床吸附技术，可以处理全细胞培养液，通过整合技术的使用，能达到萃取、浓缩和初步纯化的目的。
另外这两种技术和亲和相互作用结合可进一步提高处理的选择性。
相似的，亲和相互作用还可以整合进其它的高通量处理，如亲和膜过滤和亲和沉淀（2）。
生产上使用的非线性色谱，如置换色谱，一次层析的载量很大，得到的蛋白纯度很高，近年来也有很大的发展和应用（85,36）。