第四章色谱的定性与定量

②利用相对保留值定性
定义：相对保留值是组分i与基准物S的调整保留值之比：
is,tR i/,tR s , V R i/,V R s,
优点：可以消除某些操作条件的影响，只要柱温、 固定相不变，即使柱径、柱长、填充情况及流动 相的流速有所变化，相对保留值γ仍然不变，它是 色谱定性分析的重要参数
解：
fi 5g /1m 52 0 m 3 .3 1 2 0 g m 2m
即每平方毫米色谱峰面积代表3.3×10-2μg乙醇
例： 准确称取一定质量的色谱纯对二甲苯、甲苯、 苯及仲丁醇，混合后稀释，采用氢焰检测器，定 量进样并测量各物质所对应的峰面积，数据如下：
物质 苯 仲丁醇 甲苯 对二甲苯
h i —组分i的峰高
2.峰面积的准确测定
1）对称峰的峰高和峰面积 的测定
第一法：峰高×半高 峰宽
AhWh 2
式中： h—从峰顶到峰底线 的垂直距离 W h/2—峰高1/2处的 峰宽
第二法：三角形法
ABMWi
式中：BM—三角形的高 Wi—三角形KML的
半高宽，近似等于色 谱峰高0.607处的峰宽
计算方法：
★优点：归一化法很直观，容易接受，计算简便、 准确，当操作条件如进样量、流速等发生变化时， 对计算结果的影响很小，是一种常用的计算方法
★缺点：校正因子的测定比较麻烦，必需所有组分 都出峰
★注意： ▼主要用于GC的定量测定，当 fi相近时，可直接 用峰面积归一化法。 ▼由于检测技术的影响,HPLC中很少使用归一化
① 利用已知物直接对照进行定性分析 通常做法：把未知物和已知标准物在同一根
色谱柱上，用相同的色谱操作条件进行分析， 记录色谱图后利用保留时间进行比对
为避免载气流速和温度变化引起保留时间的 变化，可用相对保留值定性或用已知物增加峰 高法定性
已知物增加峰高法定性原理：在得到未知样 品的色谱图后，往未知样品中加入一定量的已 知物质，在同样色谱条件下的两色谱图对比图 谱比较峰高。
mS
设样品的总量为m，则待测组分i的质量分数为
w i m m i10 % 0 fiA A iS m m S10 % 0
内标法的特点：
★ 无归一化法的限制，即只要被测组分能出峰， 不和其他峰重叠，不管其他组分是否出峰或是 否重叠，都可以用内标法进行定量分析
★定量准确，受操作条件影响较小 ★ 可部分补偿待测组分在样品前处理时的损失 ★ 若加入几种内标物，还可提高定量分析的精度 ★ 内标物的选择比较困难，同时内标物称量要求
B u ty lP a ra b e n
Baidu Nhomakorabea
P ro p y lP a ra b e n
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
M in u te s
0 .1 0
0 .0 5
0 .0 0 0 .0 0
0 .5 0
1 .0 0
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
M in u te s
4 .5 0
5 .0 0
5 .5 0
6 .0 0
6 .5 0
7 .0 0
利用文献的数据进行对比和定性分析 注意HPLC的柱填充技术的复杂性，定性
准确，操作麻烦
内标标准曲线法
从内标公式可知 w i m m S i 10 % 0 fiA A iSm m S10 % 0
如果每次称取同样量(m)的试样，每次加入相等 量(ms)的内标物，则上式中m，ms，fi’均为常数，
计算公式可写为：
wi m mSi
10% 0 Ai AS
常数
③利用保留指数定性 表示物质在固定液上的保留行为，是目前使
用最广泛并被国际上所公认的定性参数，它具 有定性可靠，重现性好，标准统一等优点。
可将储存在计算机中的标准保留指数转换成 用户色谱条件下的保留指数和保留时间（tR）
（A）定义
IX100ZnllgtgR 'tR 'Zx nllgtgR 'tR 'ZZ
3.40cm2
fm 甲苯 fm （ fm （仲 甲丁 苯醇 ） AA（ ） （仲 甲丁 苯醇 m ） m （ （ ）仲 甲丁 苯
3.400.81491.06 4.10 0.6325
fm 苯 0.98 fm 对二 甲 1.1苯 0
（二）定量方法
1.归一化法 ★定义：把所有出峰的组分含量之和按100%计的 定量方法称为归一化法，是一种相对定量方法。 ★前提：样品中的所有组分都能流出色谱柱，而 且在检测器上所有的组分都能产生信号。
2)不对称峰峰高和峰面积的测 量
第一法：峰高×峰宽的平均值
Ah1 2b0.15b0.85
式中：h—峰顶到峰底线的垂 直距离 ½（b0 .15+b0.85)—峰高0.15 处和峰高0.85处的峰宽平均 值
第二法：峰分割计算后加和法 A=A1+A2 =h1×b1+h2×b2
第三法：大峰上的小峰峰面积的测量
IX100Zllgg tR t' R 'Zx1llgg tR t' R 'ZZ
（B）保留指数的测定
保留指数的准确度和重现性都很好，用同一色 谱柱测定误差小于1%，因此只要柱温和固定液相 同，就可以用文献上发表的保留指数定性。
（2）液相色谱中用保留值定性的方法
种相对的定量方法 定量分析的方法： 在某些限定条件下，检测器响应值（色
谱峰的峰面积或峰高）---所测组分的数量或 浓度成正比，
即：
w iC i fiA ih i
w 式中： –组分i的质量 i c i —组分i的浓度 f i —组分的校正因子（与检测器的性质和被 测组分的性质有关）
A i —组分i的峰面积，
mi
fm

Ai ms
As
式中：mi , ms-被测物质、基准物质的质量 Ai , As-被测物质、基准物质的峰面积
②摩尔校正因子(fM) 定义：物质的量用摩尔数表示，表示单位峰面积所 代表的组分摩尔数
fMA Asi m msi M Msi fmM Msi
式中：Mi , Ms-被测物质、基准物质的摩尔质量
（4）校正因子的实验测量方法 ★样品的准备：测定校正因子时，要精密称定适 量色谱纯的被测组分和基准物质，配制成已知准 确浓度的样品。
★样品的测定：在已确定的色谱条件下，取准确 体积的样品进样，从谱图上获得准确的峰面积
★计算：根据相对校正因子的计算公式可以算出 质量（或摩尔或体积）校正因子
例： 某试样合有5μg乙醇，测得相应的色谱峰面积 为150mm2，求乙醇的fi。
m/μg 0.4720 0.6325 0.8149 0.4547
A/cm2 2.60
3.40 4.10
2.20
以仲丁醇为标准，计算各物质的相对质量校正因子。
fm仲丁醇 03..6430c2m 2g5 fm甲苯 04..8110c4m g29
0.814g9
fm 甲苯 fm fm 仲 甲丁 苯 醇04.6.130c2m2g51.06
（3）平面色谱中用保留值定性的方法
定性方法：比较未知组分和已知标准物质的比移值 影响比移值的因素：固定相的性质、展开剂的性质、
被分离组分的性质、展开时的温度等 注意事项
①展开槽应密闭 ②沿分离轨迹固定相与流动相无梯度变化 ③展开剂的前沿位置能正确测定
2.联机定性
联机定性是指把色谱和质谱、红外、紫外 和核磁共振法联合使用 联用方式： 第一种：先收集色谱分离后的组分，再用“四 大谱”的方法进行定性分析 第二种：通过“接口”技术直接把色谱和“四 大谱”仪器连接起来，对每一被分离的组分 进行定性分析
绝对校正因子fi的大小主要由操作条件和 仪器的灵敏度所决定，既不容易准确测量，也 无统一标准；当操作条件波动时，fi也发生变 化。故fi无法直接应用，定量分析时，一般采 用相对校正因子。
（2）相对校正因子（校正因子）：
f

fi fs

mi ci ms cs
Ai hi
As hs
二、色谱定量分析
定量分析的具体内容 • 确定样品的类型，主要成分/痕量成分 • 使分析条件的分离度（R）大于：1.5 • 色谱峰的定性，峰一致性测定 • 检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围 • 用标样建立标准曲线 • 检查方法的准确度及精确度 • 用标样定期检查方法
（一）定量分析基础
1.定量分析的基本公式 定量分析的目的： 要确定样品中某一组分的准确含量，是一
式中：f -- 相对校正因子 ，简称为校正因子， 无因次量
fi , fs—i 物质、基准物质（s）的质量 （或浓度)
Ai(hi),As(hs)---物质、基准物质的峰面积 （或峰高）
根据物质量的不同表示方法，校正因子分为：
①质量校正因子(fm) 定义：当物质量用质量来表示时的校正因子称
为质量校正因子 (fm),表示单位峰面积所代表的组 分质量，质量一般用 g 或 mg 表示.
第四法：基线漂移时色谱峰峰面积的测量
第五法：重叠峰峰面积的测量
3.定量校正因子的测定
（1）绝对校正因子（fi) ★ fi的物理意义:单位峰面积所代表的I组分的量,
是一个与i组分的物理化学性质和检测器的性质 有关的常数
★定量校正 因子的计算公式为：
fi

mi ci Ai hi
注意:峰高定量校正因子fi(h)受操作条件影响较大
实际色谱图
50 40
标样峰面积 30 内标样峰面积 20
10 0
0
1 .8 0 1 .6 0 1 .4 0 1 .2 0 1 .0 0
v o lts
0 .8 0 0 .6 0 0 .4 0 0 .2 0 0 .0 0
2 .0 0
M e th y lP a ra b e n
E th y lP a ra b e n
第四章 色谱的定性和定量方法
一、色谱的定性分析
1、利用保留值定性 鉴别每个色谱峰
–通过比较保留值(通常是保留时间)的方法，找 到各色谱峰所对应的组份
–大多数情况下用比较保留时间来定性 即所谓： 保留时间相同，可能是同样的组份 保留时间不同，肯定不是同样的组份
（1）气相色谱中用保留值定性的方法
保留值定性的主要方法 ★直接与已知标准物对照 ★某一未知峰和已知标准物的保留值完全相 同—可能是 ★改变色谱柱或流动相，保留时间仍完全相同—基本是
0 .4 0
E th ylp a ra b e n
0 .3 5
0 .3 0
0 .2 5
AU
0 .2 0
0 .1 5
U ra cil
P ro p ylp a ra b e n
③体积校正因子（fv）
定义：物质的量用体积表示,表示单位峰面积 所代表的组分体积。
Vi
fV

Ai
Vs
As
式中：Vi , Vs—表示被测物质、基准物质的体积
(3)相对响应值sˊ 相对响应值是物质i与标准物质S的响应值（灵敏
度）之比。单位相同时，与校正因子互为倒数， 即：
与只与试样、标准物质以及检测器类型有关，而 与操作条件和柱温、载气流速、固定液性质等无 关，是一个能通用的常数。
2、内标法
内标法：选择适宜的物质作为待测组分的参 比物，定量加到样品中去，根据待测组分 和参比物在检测器上的响应值之比和参比 物加入量进行定量分析的方法。
键：选择合适的内标物 内标物的选择原则： A、内标物必须是原样品中不存在的物质，其性质尽
量与待测组分相近(同系物、异构体) B、内标物不能和被测组分起化学反应，要能完全溶
受到限制
最简单的方法：标 准添加法
前提：要有标准物
判断的标准：加入 标准样后，使未知 样色谱峰增高，改 变色谱条件，未知 峰仍能增高
• 同时用其他方法 – 其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱） – 其他检测器 • PDA，光谱图比较、谱库检索 确认色谱峰的纯度 - 保证每个色谱峰下只有一个被测的组份 -检查是否有共流出的物质（杂质）干扰 色谱峰纯度确认的方法 -用光电二极管矩阵检测器比较光谱图 -峰纯度鉴定，四波长比例 • MS，质谱图解析、谱库检索 – 其他仪器方法
于被测样品中； C、内标物的峰尽可能接近待测组分的峰，或位于几
个待测组分的中间，但必须和样品中的所有峰完 全分离； D、内标物的加入量应和待测组分相近。
mi fi Ai mS fSAS
mi mS
fi Ai fS AS
fi
Ai AS
待测组分(i)的量mi为：
mi

fi
Ai AS