电泳技术

电泳迁移率cm2/(V·s) 分子量
5.9×10-5
69 000
5.1×10-5
200 000
4.1×10-5
300 000
2.8×10-5 90 000～150 000
1.0×10-5 156 000～300 000
▪
二 、影响电泳迁移率的因素
▪ （一）样品 ▪ 被分离物质的带电荷量和电泳速度成正比。 ▪ 带电荷量越多，电泳速度越快。 ▪ 若带电量相同，分子量大的电泳速度慢。分
子大小与电泳速度成反比。
▪ （二）电场强度
▪ 电场强度也称电势梯度，是指单位长度 （每1cm）的电压降（电位降）。
▪ 常压电泳的电场强度一般为2～10 V/cm， 高压电泳的电场强度一般为20～200V/cm。 常压电泳多用于分离蛋白质等大分子物质， 高压电泳则用来分离氨基酸、小肽、核苷 等小分子物质。
▪ I=ΣCiZi2/2
▪ I：离子强度，Ci：离子的浓度，Zi： 离子的价数，Σ代表累加。
▪ 例：求0.015M Na2SO4溶液的离子强度： ▪ I=（0.015×2×12+0.015×22）/2=0.045
（mol/L）
▪ 缓冲液的离子强度影响缓冲容量、产热效 应和电泳速度。离子强度大，缓冲容量大， pH值稳定；但离子强度大，电泳速度慢； 同时离子强度大，电流强度大，产热多， 蒸发快。速度慢，会导致时间过长，标本 扩散。速度快，导致区带不整齐，分辨率 低。综合考虑，离子强度最好选在0.02～ 0.2mol/L之间。
▪ （二）按照电泳媒介不同（有无支持 物），分为自由电泳和区带电泳
▪ 1．自由电泳 自由电泳的媒介为溶液 （不用支持物），带电粒子在溶液中 自由移动，适用于生物细胞和生物大 分子的电泳分离，如显微电泳、等电 聚焦电泳、密度梯度电泳等。
▪ 2．区带电泳 媒介为支持介质，被分 离的物质经电泳后在支持介质上形成 区带称为区带电泳。区带电泳是目前 应用最广泛的一种电泳技术，适用于 蛋白质、核酸等标本的分离。区带电 泳根据支持介质的不同又分为滤纸电 泳、醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝 胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
▪ 当分离某一蛋白质混合物时，应选择一种 能扩大各种蛋白质所带电荷量差异的pH值， 以利于各种蛋白质的分离，当然不能过酸 过碱，以免引起蛋白质变性。缓冲液的pH 值一般设在4.5～9.0为宜。
▪ 3．离子强度 除了要求缓冲液具有合 适的化学组成和pH值以外，还要求具 有一定的导电能力。缓冲液的导电能 力可用离子强度表示。在稀溶液中离 子强度可用下式计算：
一、电泳迁移率
▪ 在溶液中，若能吸附带电质点或者带有可 解离基团的物质在一定的pH条件下在直流 电场中收到所带电荷相反的电极吸引而发 生移动。
▪ 根据Stoke定律，用Q表示颗粒带电量，v 表示电泳速度（cm/s），E表示电场强度 （V/cm），颗粒半径r，介质粘度系数η。
v=EQ/(6π·r·η)
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▪ 迁移率（μ）：带电颗粒在单位电场强度下 的电泳速度。
▪ μ=v/E=Q/(6π·r·η)
▪ 各种带电物质在一定的条件下测得的迁移 率是一物理常数。
表2-1 血清蛋白等电点与电泳迁移率
血清蛋白 等电点
白蛋白
4.84
α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白
5.06 5.06 5.12
γ-球蛋白 6.85～7.30
二、电泳技术的分类
▪ 电泳技术的分类方法有多种，可从分 离目的、电场强度、电泳媒介、电泳 装置、缓冲液pH等不同角度进行分类。
▪ （一）按照电场强度的不同，分为常 压电泳和高压电泳
▪ 常压电泳的电场强度一般在2~10V/cm （电压在500V以下）
▪ 高压电泳的电场强度一般在 20~220V/cm（电压在500V以上）
▪ 1．缓冲液的化学组成（缓冲溶质） 缓冲 体系的组成常选用弱酸/弱酸盐、酸式盐/次 级盐。对缓冲液的要求是化学性质稳定、
电导率低、缓冲容量大、粒子移动性好。 按此要求，缓冲液的pH值确定后，第一， 选择缓冲液时要尽量选择pKa接近缓冲液 pH的弱酸成分，此时缓冲容量最大。第二， 优先选用离子价数为1价的电解质，目的是 保持离子的活度。第三，优先选择正、负 离子移动速度相近的电解质，使电泳时离 子分布均匀，保证电泳区带的整齐。
▪ 常用的缓冲液有巴比妥/巴比妥钠、柠 檬酸/柠檬酸钠、NaH2PO4/Na2HPO4、 Tris/HCL等。巴比妥/巴比妥钠是血清 蛋白电泳常用的电泳缓冲液。
▪ 2．pH值 溶液的pH值决定了带电颗粒解 离的程度，也决定了物质所带净电荷的多 少。
▪ 如缓冲溶液的pH值大于待分离的蛋白质的 等电点pI，则蛋白质带负电荷，在电场中 向正极移动。
▪ 2．不连续pH电泳 支持介质各处的 pH不同，聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电 聚焦电泳等。
三、电泳技术的特点
▪ 1．凡是带电物质均可应用某一电泳技术进 行分离，并可进行定性或定量分析。
▪ 2．分辨率高。 ▪ 3．可在常温下进行。 ▪ 4．样品用量少。 ▪ 5．操作省时简便。 ▪ 6．设备简单。
第二节 电泳技术的基本原理
▪ 电泳速度与支持介质两端的电压成正比。
▪ 例如：以滤纸作支持物，其两端浸入 电极缓冲液中，电极缓冲液与滤纸交 界面的纸长20cm，测得的电压降为 200V，那么，电场强度为 200V/20cm=10V/cm。
▪ （三）电泳缓冲液
▪ 电泳缓冲液起着决定粒子电荷性质和 电荷量的作用，同时起导电作用，电 泳时对缓冲液的化学组成、pH值和离 子强度都有一定的要求。
第三节 电泳技术
electrophoresis technology
第一节 概述
一、电泳技术的概念
▪ 在直流电场中，带电粒子向与其电性 相反的电极移动的现象称为电泳 （electrophoresis）。
▪ 利用各种带电粒子电泳速度不同，对 物质进行分离，然后对物质进行定性 和定量的分析方法称为电泳分析法， 也叫电泳技术。
▪ （三）按照分离目的的不同，分为分 析电泳和制备电泳。
▪ （四）按照支持物的装置形式（电泳 装置）不同，分为水平电泳（支持物 水平放置，最常用）和垂直电泳等。
▪ （五）按照缓冲液pH值是否均一分为 连续pH电泳和不连续pH电泳。
▪ 1．连续pH电泳 支持介质各处的pH 相同，如滤纸电泳、醋酸纤维素薄膜 电泳等。