实验 凝胶渗透色谱法测定分子量(讲义)
凝胶渗透色谱讲课文档
Hostavin N30
Column:
2xPLgel 3µm MIXED-E
Flow rate:
1.0ml/min
Injection volume: 20µl
Detector:
PL-ELS 1000
Eluent Modification in Organic GPC - Acids
▪ Some acidic samples
谱被称作 传统GPC
第30页，共55页。
RI/V 检测器结合使用
VI的响应值正比于 C H / M = C []
H，大分子的尺寸；流体力学体积 [] = VI / RI，特征粘度(intrinsic viscosity)
普适校正的假设：
具有同样大小(H)的大分子应有同样的洗脱体积， 即依赖性
– H = MST [] ST
for each standard
增加分子量
聚合物的各种平均分子量
Mn：用渗析计测出(Osmometry) Mw：用光散射计测出(Light Scattering) Mv：用粘度计测出(Viscometry) Mz及Mz+1：用超速离心法测出(Ultracentrifuge) Mw/Mn：为多分散性(Polydispersity) Mn<Mv<Mw<Mz<Mz+1
▪ Can cause peak shape
variation due to mismatch in pore volume
聚合物色谱中的检测器
浓度
响应值正比于浓度C 实例：示差(refractometer)检测器
N = (dn/dc) C
紫外检测器
蒸发光散射检测器
使用单一浓度型检测器的体积排除分离模式色
凝胶色谱的讲义第一章(1)
凝胶色谱的讲义第一章(1)第一章前言一、高聚物及多糖平均分子量及其分布1、高聚物的平均分子量除天然聚合物外，合成聚合物都是以单体为原料经过聚合反应而制得的。
每个聚合物分子都是由数目很大的单体分子加成或缩合而成，所以合成聚合物的分子量比单体要大千百倍甚至成万倍。
另一方面，根据绝大多数的聚合反应机理预示，生成的聚合物的分子量是不均一的，也就是说每个聚合物分子可以由不同数目的单体分子聚合而成，所以各聚合物的分子量是不相等的，这种现象叫做聚合物的分子量的不均一性或多分散性。
高聚物分子量的多分散性使分子量的表征比小分子要复杂一些，拿一个高聚物试样来说，由于试样内包含有许许多多个高分子，这些高分子的分子量可以分布在相当大的范围内。
例如，试样中可以包含尚未聚合的单体、含二个、三个、四个、…单体的低聚物以及聚合度不同的高分子，对这样一个多分散的体系来说，我们要表征它的分子量就需要用统计的方法，求出试样分子量的平均值和分子量分布、由于应用统计方法的不同，即使对同一个试样，也可以有许多不同种类的平均分子量；例如，某一个高聚物试样中含有N1个分子量为M；的分子，N2个分子量为M2的分子，N3个分子量为M3的分子，……Ni-1个分子量为Mi-1的分子以及Ni个分子量为MI 的分子，我们就可以根据定义算出它的各种平均分子量。
下面是四种最常用的平均分子量定义：这里：YMx分子量名称Mn数均分子量1Mw重均分子量2MzZ均分子量3MZ+1Z+1均分子量Mw/Mn分子量分布Mp峰位分子量另外，粘均分子量：很显然，同一个试样应用不同的统计方法所算出来的不同种类的平均分子量的数值是不同的。
一般情况下，多分散样品的平均分子量有以下次序：Mz＞Mw ＞M η＞Mn 2．高聚物的分子量分布高聚物的分子量分布是指试样中各种大小不等的分子量组分在总量中所占的各自的分量，它可以用一条分布曲线或一个分布函数来表示。
例如，当我们知道高聚物试样中分于量为M1、M2、M3、…、Mi各组分在总重量中所占的重量分数分别为W1 、W2、W3 、…、Wi 时，我们就可以用对应的W和M作图，得到分子量分布曲线。
凝胶渗透色谱法测定聚氯乙烯的分子量分布
凝胶渗透色谱法测定聚氯乙烯的分子量分布凝胶渗透色谱法是一种常用的测定高分子化合物分子量分布的
方法。
该方法基于高分子在凝胶柱中的渗透速率不同而实现分离。
聚氯乙烯是一种常见的塑料材料，其分子量分布对其性能和应用具有重要影响。
本文将介绍如何利用凝胶渗透色谱法测定聚氯乙烯的分子量分布。
首先，准备样品。
将聚氯乙烯样品溶解于合适的溶剂中，并将其过滤以去除杂质和颗粒物。
将样品注入凝胶柱中，通常使用聚丙烯酰胺凝胶柱。
在注入样品前，必须对凝胶柱进行校准，以确保凝胶孔径的一致性。
接下来，将凝胶柱连接到色谱仪，并以适当的流速进行操作。
当样品进入凝胶柱时，分子量较大的聚合物分子会受到较大的阻力，因此在凝胶柱中的渗透速度较慢。
相反，分子量较小的聚合物分子会受到较小的阻力，因此在凝胶柱中的渗透速度较快。
这样，聚合物分子将被分离并按分子量分布逐渐排列。
最后，使用检测器检测样品，通常使用光散射检测器。
光散射检测器可以测量聚合物分子的光散射强度，并据此计算其分子量分布。
将测得的数据经过处理和分析，即可得到聚氯乙烯的分子量分布。
总之，凝胶渗透色谱法是一种常用的测定聚合物分子量分布的方法，对于测定聚氯乙烯的分子量分布也十分适用。
该方法操作简单、可靠，可以用于质量控制和研究聚合物性质的分析。
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凝胶渗透色谱法测定聚合物的相对分子量及其分布
凝胶渗透色谱法测定聚合物的相对分子量及其分布一般人工合成的聚合物均为不同相对分子质量的同系物组成的混合物，其相对分子质量为统 计平均值，相对分子质量的多分散性可用分子量分布来表征。
分子量分布是指聚合物样品中各级 分的含量与相对分子质量的关系。
聚合物的许多物理机械性能与分子量分布有密切的关系，因此 进行聚合物分子量分布上的测定具有重要的意义；另一方面，聚合物的分子量分布是由聚合过程 或解聚过程的机理决定的，因此无论是为了研究聚合或解聚机理及其动力学，或者是为了更好控 制聚合及成型加工的工艺，都需要测定聚合物的相对分子质量及其分布。
一、 实验目的1. 掌握凝胶渗透色谱的分离、测量原理； 2. 了解凝胶渗透色谱的仪器构造和凝胶渗透色谱的实验技术。
二、 实验原理 凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，简称 GPC）也称为体积排除色谱（Size Exclusion Chromatography，简称 SEC）是一种液体（液相）色谱。
和各种类型的色谱一样，GPC/SEC 的作用也是分离，其分离对象是同一聚合物中不同相对分子质量的高分子组分。
（一） GPC 的分离机理—体积排除理论 1. GPC 的分离部件是以多孔性凝胶作为载体的色谱柱，凝胶的表面与内部含有大量彼此贯 穿的大小不等的孔洞。
GPC 法就是通过这些装有多孔性凝胶的分离柱，利用不同相对分子质量 的高分子在溶液中的流体力学体积大小不同进行分离，再用检测器对分离物进行检测，最后用已 知相对分子质量的标准物对分离物进行校正的一种方法。
2. 在聚合物溶液中，高分子链卷曲缠绕成无规线团状，在流动时，其分子链间总是裹挟着 一定量的溶剂分子，即表现出的体积称之为“流体力学体积”。
对于同一种聚合物而言，是一组 同系物的混合物，在相同的测试条件下，相对分子质量大的聚合物，其溶液中的“流体力学体积” 也大。
3. 作为凝胶的物质要具有以下性质：表面的孔径与聚合物分子的大小是可比的，并且孔径 应有一定的分布；作为凝胶要有一定的机械强度、一定的热稳定性和化学稳定性；对于极性较强 的分子，还要考虑到凝胶的极性等。
凝胶渗透色谱法测高聚物的分子量分布
凝胶渗透色谱法测高聚物的分子量分布聚合物的分子量及分子量分布是聚合物性能的重要参数之一，它对聚合物的物理机械性能影响很大。
在聚合物分子量的测定方法中凝胶渗透色谱法（gel permeation chromatography, GPC）由于其快速方便的特点受到了广泛的应用。
一、实验目的1．了解凝胶渗透色谱法测高聚物分子量分布的原理2．熟悉安捷伦型凝胶渗透色谱仪的简单工作原理和操作。
二、GPC简单原理凝胶渗透色谱（Gel Permeation chromarography 简称GPC）为一种液体色谱，是一种很有效的分离技术。
其分离过程在装填有多种固体的“凝胶”小球的谱柱中进行。
凝胶多为高交联度的聚苯乙烯或多孔硅胶。
这些凝胶孔径的大小要与所分离聚合物的分子尺寸相同。
用待测样品的良溶剂不断淋洗色谱柱，当把用相同溶剂制备的试样稀溶液注入柱前淋洗液中后，待高聚物从柱的尾竿流出时，即得分级。
关于GPC的分离机理，目前尚无一完备的理论，但就目前存在的理论可以分为三大类：平衡排除理论；限制扩散理论；流动分离理论。
其中最常用的，认为起主要作用的是平衡排除理论；流速较低时扩散在分离过程中是不重要的；至于液动分离机理则只在液速很高时才起作用。
按照此理论，GPC是基于大分子尺寸不同而进行分级的。
凝胶孔洞的大小有一定的分布，当溶解的聚合物分子液以多孔小球时，扩散到凝胶孔结构内去的程度依赖于分子的尺寸和凝胶孔径的大小和分布。
尺寸大的分子只能进入凝胶内层的一小部分，或完全被排除在外；而尺寸小的分子则能渗透到大部分的凝胶内层中去，因此分子的尺寸越大，在柱中走的路程越短，相反，分子的尺寸越小，在柱中的路程越长，保留时间也就越长。
这样，当高聚物流经色谱柱时，就按其分子量的大小分开，大分子首先流出，达到分级的目的。
分离过程如图1。
图1 GPC 的分离原理柱子的总体积可分为三部分：凝胶粒间体积V 0，凝胶骨架体积V GM ，凝胶总孔洞体积V i ；如果柱子的总体积为V t则： V t ＝V 0＋V i ＋V GM （1）如果某种尺寸的大分子可进入的孔洞体积为V i acc ，则其淋出体积V c 应为：我们定义分配系数为：i i d V acc V /K ⋅= （2） i d c V K V V +=0 （3）如果K d ＝1，则该分子可进入全部孔洞，此时V c ＝V 0＋V i ；如果K d ＝0则该分子完全被排斥在孔洞之外，此时V ＝V 0。
第二部分 凝胶渗透色谱法测定分子量及其分布的标定方法
凝胶渗透色谱的技术进展及其在高聚物中的应用第二部分凝胶渗透色谱法测定分子量及其分布的标定方法一、凝胶渗透色谱法测定高聚物的分子量及分子量分布高聚物的分子量及分子量分布的，是研究聚合物及高分子材料性能的最基本数据之一。
它涉及到高分子材料及其制品的力学性能，高聚物的流变性质，聚合物加工性能和加工条件的选择。
也是在高分子化学、高分子物理领域对具体聚合反应，具体聚合物的结构研究所需的基本数据之一。
在凝胶色谱技术应用之前，许多经典方法都可以测定高聚物的相对分子质量，如端基测定法、渗透压法、粘度法等，但在测定时都有局限。
在相对分子质量分布（多分散性指数）成为人们关注的热点后，经典方法却不能同时测定聚合物的相对分子质量分布。
凝胶（渗透）色谱(GPC)的应用改善了测试条件，并提供了可以同时测定聚合物的相对分子质量及其分布的方法，使其成为测定高分子相对分子质量及其分布最常用、快速和有效的技术。
而GPC与多检测器的连用技术使得现在的凝胶色谱方法能够提供更丰富的聚合物的结构信息。
就方法本身的性质而论，GPC测定高聚物的分子量及其分子量分布，常用的是一种相对的测定方法，因此，在用GPC 测定高聚物时，首先要解决的问题是建立GPC标定线。
可见，标定线的准确与否将直接影响到测量结果的可靠性。
二、GPC测定高聚物的分子量及其分布的标定方法由于高聚物分子结构的多样性，针对不同类型的高聚物，各国学者对GPC标定方法进行了深入的研究，并提出了多种形式的标定方法。
主要有以下几种标定方法：窄分布标样校正法、窄分布高聚物级分标定法、宽分布标样标定法、渐进校正法法、无扰均方末端距标定法及有扰均方末端距标定法、普适校正法。
1.窄分布标样标定法用一组已知分子量的窄分布标样订定GPC标定线，以此来测定相同化学结构试样的分子量及其分布的方法叫窄分布标样标定法。
所谓窄分布标样，是指高聚物的分子量分布宽度指数D值(/ )小于1.05，当用光散射法、渗透压法(----或蒸汽压法)、粘度法测定标样的分子量时，各种方法测得的分子量必须一致。
凝胶渗透色谱 聚苯胺
凝胶渗透色谱聚苯胺凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，简称GPC）是一种分离和分析高分子化合物的有力工具。
聚苯胺（Polyaniline）是一种导电聚合物，由于其独特的电学性质和化学反应性，被广泛应用于电池、传感器、催化剂等领域。
下面就以聚苯胺为例，介绍凝胶渗透色谱的应用。
一、凝胶渗透色谱法测定聚苯胺的分子量采用凝胶渗透色谱法可以测定聚苯胺的分子量及分子量分布。
实验步骤如下：1.准备试剂和仪器：选择合适的凝胶色谱柱，如Sephadex G-100、G-25等，准备好洗脱液（如0.05 M磷酸盐缓冲液），检测器（如UV-Vis），柱后反应器，输液泵等。
2.安装色谱柱：将凝胶色谱柱安装在支架上，确保柱身垂直。
3.装填凝胶：将所选凝胶均匀地装填在色谱柱内，注意避免气泡。
4.平衡色谱柱：用洗脱液平衡色谱柱，直至基线稳定。
5.样品准备：将聚苯胺样品溶解在合适的溶剂中，浓度约为0.1 g/L。
6.进样分析：将样品溶液通过输液泵泵入色谱柱，记录各个组分的洗脱体积。
7.数据处理：根据洗脱体积和标准曲线，计算聚苯胺的分子量和分子量分布。
二、凝胶渗透色谱法研究聚苯胺的分子链结构除了测定分子量，凝胶渗透色谱法还可以用于研究聚苯胺的分子链结构。
通过对比不同分子量的聚苯胺样品的色谱图，可以观察到不同分子量组分的分布情况，从而推断出聚苯胺分子链的结构特征。
此外，结合其他表征手段如红外光谱、核磁共振等，可以对聚苯胺的化学结构进行更深入的研究。
三、凝胶渗透色谱法在聚苯胺合成中的应用在聚苯胺合成过程中，凝胶渗透色谱法可以用于监控反应进程和纯化产物。
通过实时监测色谱图中的峰形和峰强变化，可以判断反应是否进行完全，以及产物的纯度如何。
此外，利用凝胶渗透色谱法还可以对合成产物进行分级分离，得到不同分子量的聚苯胺样品，用于后续研究和应用。
综上所述，凝胶渗透色谱法在聚苯胺的分析、合成以及应用中具有广泛的应用价值。
凝胶渗透色谱法测定聚合物的分子量分布
凝胶渗透色谱法测定聚合物的分子量分布合成聚合物一般是由不同分子量的同系物组成的混合物，具有两个特点：分子量大和同系物的分子量具有多分散性。
目前在表示某一聚合物分子量时一般同时给出其平均分子量和分子量分布.分子量分布是指聚合物中各同系物的含量与其分子量间的关系，可以用聚合物的分子量分布曲线来描述。
聚合物的物理性能与其分子量和分子量分布密切相关，因此对聚合物的分子量和分子量分布进行测定具有重要的科学和实际意义。
同时，由于聚合物的分子量和分子量分布是有聚合过程的机理所决定,通过聚合物的分子量和分子量分布与聚合时间的关系可以研究聚合机理和聚合动力学。
测定聚合物分子量的方法有多种，如粘度法、端基分析法、超离心沉降法、动态/静态光散射法和凝胶色谱法（GPC）对等；测定聚合物分子量分布的方法主要有三种:(1）利用聚合物溶解度的分子量依赖性,将试样分成分子量不同的级分,从而得到试样的分子量分布，例如沉淀分级法和梯度淋洗分级法。
(2）利用聚合物分子链在溶液中的分子运动性质得出分子量分布．例如：超速离心沉降法。
（3)利用聚合物体积的分子量依赖性得到分子量分布,例如：体积排除色谱法(或称为凝胶色谱法）。
凝胶色谱法具有快速、精确、重复性好等优点，目前成为科研和工业生产领域测定聚合物分子量和分子量分布的主要方法。
一、实验目的和要求1、了解凝胶渗透色谱的测量原理，初步掌握GPC的进样、淋洗、接收、检测等操作技术。
2、掌握分子量分布曲线的分析方法，得到样品的数均分子量、重均分子量和多分散性指数.二、实验装置与原理1、分离机理GPC是液相色谱的一个分支,其分离部件是一个以多孔性凝胶作为载体的色谱柱，凝胶的表面与内部含有大量彼此贯穿的大小不等的空洞.色谱柱总面积Vt由载体骨架体积Vg、载体内部孔洞体积Vi和载体粒间体积V0组成。
GPC的分离机理通常用“空间排斥效应”解释。
待测聚合物试样以一定速度流经充满溶剂的色谱柱,溶质分子向填料孔洞渗透，渗透几率与分子尺寸有关，分为以下三种情况:(1）高分子尺寸大于填料所有孔洞孔径，高分子只能存在于凝胶颗粒之间的空隙中,淋洗体积Ve=V0为定值；(2）高分子尺寸小于填料所有孔洞孔径，高分子可在所有凝胶孔洞之间填充,淋洗体积Ve=V0+Vi为定值；（3）高分子尺寸介于前两种之间，较大分子渗入孔洞的几率比较小分子渗入的几率要小，在柱内流经的路程要短，因而在柱中停留的时间也短，从而达到了分离的目的。
实验七凝胶渗透色谱法测定聚合物分子质量及其分布
实验七凝胶渗透色谱法测定聚合物分子质量及其分布实验七凝胶渗透色谱法测定聚合物的相对分子质量及其分布一、实验目的 1.了解凝胶渗透色谱法测定聚合物相对分子质量及其分布的原理。
2.了解凝胶渗透色谱仪的仪器构造和初步掌握凝胶渗透色谱仪的实验技术。
3．测定聚苯乙烯样品的相对分子质量及其分布。
二、实验原理聚合物的相对分子质量量及其分布是聚合物性能的重要参数之一，它对聚合物材料的物理机械性能和可加工性等影响很大。
测定聚合物的相对分子质量及其分布的最常用、快速和有效的方法是凝胶渗透色谱法。
1. GPC分离机理 GPC是一种新型液相色谱，除了能用于测定聚合物的相对分子质量及其分布外，还广泛用于研究聚合物的支化度、共聚物的组成分布及高分子材料中微量添加剂的分析等方面。
同各种类型的色谱一样，GPC具有分离功能，其分离机理比较复杂，目前还未取得一致的意见。
但在GPC的一般实验条件下，体积排除分离机理被认为起主要作用。
体积排除分离机理的理论认为：GPC的分离主要是由于大小不同的溶质分子在多孔性填料中可以渗透的空间体积不同而形成的。
装填在色谱柱中的多孔性填料的表面和内部分布着大小不同的孔洞和通道。
当被测试的多分散性试样随淋洗溶剂进入色谱柱后，溶质分子即向填料内部孔洞渗透，渗透的程度取决于溶质分子体积的大小。
体积较大的分子只能进入较大的孔洞，而体积较小的分子除了能进入较大的孔洞外还能进入较小的孔洞，因此体积不同的分子在流过色谱柱时实际经过的路程是不同的，分子体积越大，路程越短。
随着溶剂淋洗过程的进行，体积最大的分子最先被淋洗出来，依次流出的是尺寸较小的分子，最小的分子最后被淋洗出来，从而达到使不同大小的分子得到分离的目的。
以上为GPC机理的一般解释。
按照一般的色谱理论，试样分子的保留体积VR可用下式表示： Ve=Vo+KVi 式中，Ve为淋出体积，即指溶液试样从进色谱柱到被淋洗出来的淋出液总体积；Vo为柱中填料粒子的粒间体积；Vi为柱中填料粒子内部的孔洞体积；K为分配系数，即可以被溶质分子进入的粒子孔体积与粒子的总孔体积之比。
凝胶渗透色谱法测定聚氯乙烯的分子量分布
凝胶渗透色谱法测定聚氯乙烯的分子量分布凝胶渗透色谱法是一种广泛应用于聚合物分析领域的方法，可以用于测定聚合物的分子量分布。
聚氯乙烯是一种常见的聚合物，在工业生产和日常生活中都有广泛应用。
因此，凝胶渗透色谱法也常用于聚氯乙烯的分析。
凝胶渗透色谱法的基本原理是根据聚合物分子量大小不同，它们在凝胶柱中的渗透速率也不同。
大分子量的聚合物渗透速率较慢，小分子量的聚合物渗透速率较快。
通过测量样品在凝胶柱中的渗透速率，可以得到聚合物的分子量分布。
针对聚氯乙烯的分析，凝胶渗透色谱法通常使用聚苯乙烯凝胶柱。
在测定前，需要将聚氯乙烯样品溶解在合适的溶剂中，并加入适量的色谱专用添加剂。
样品进入凝胶柱后，随着时间的推移，不同分子量的聚氯乙烯会分别渗透进入凝胶柱中，最终在检测器处形成峰状图谱。
通过比较峰的面积和峰的位置，可以获得聚氯乙烯的分子量分布情况。
总之，凝胶渗透色谱法是一种重要的聚合物分析方法，可用于测定聚氯乙烯的分子量分布。
它具有分析速度快、精度高、操作简便等特点，在聚合物工业生产和质量控制过程中发挥着重要作用。
- 1 -。
凝胶渗透色谱 蛋白质 分子量
凝胶渗透色谱蛋白质分子量
凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，GPC），又称为凝胶过滤色谱（Gel Filtration Chromatography，GFC），是一种常用的蛋白质分子量分析方法。
凝胶渗透色谱通过将待测蛋白质样品溶解在适当的流动相中，将其加入到高分子量的凝胶柱中进行分离。
凝胶柱内部具有多孔结构，不同分子量的蛋白质会在凝胶柱中以不同的速率渗透。
较大分子量的蛋白质会较快地通过凝胶柱，而较小分子量的蛋白质会较慢地通过。
因此，根据蛋白质在凝胶柱中的渗透速率，可以得到蛋白质分子量的分布情况。
凝胶渗透色谱可以提供蛋白质的相对分子量范围，通常以分子量标准品进行校正。
常见的凝胶材料包括琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等，选择合适的凝胶材料和流动相条件可以实现不同范围分子量的分析。
需要注意的是，凝胶渗透色谱只能提供相对分子量信息，并不能确定蛋白质的精确分子量。
如果需要精确测定蛋白质的分子量，通常需要使用其他技术，如质谱分析。
总结：凝胶渗透色谱是一种常用的蛋白质分子量分析方法，通过测定蛋白质在凝胶柱中的渗透速率来推断其相对分子量范围。
高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量
高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量一、本文概述多糖作为一种重要的生物大分子，广泛存在于自然界中，具有多种生物活性，如免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等。
因此，对多糖的纯度及分子量的准确测定对于其研究和应用具有重要意义。
高效凝胶渗透色谱法（High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）是一种常用的多糖纯度及分子量测定方法，具有操作简便、分辨率高、重现性好等优点。
本文旨在介绍HPGPC法测定多糖纯度及分子量的原理、实验步骤、数据处理及注意事项，以期为多糖的研究和应用提供参考。
二、实验材料与方法1 多糖样品：选择待测定的多糖样品，确保其来源清晰，无杂质污染。
2 高效凝胶渗透色谱（HPGPC）柱：选择适当型号的HPGPC柱，以适用于待测多糖样品的分子量范围。
3 流动相：通常选用适当的溶剂或缓冲液作为流动相，以保证多糖样品在色谱柱上的良好分离。
4 检测器：使用示差折光检测器（RI）或紫外检测器（UV）等，以监测多糖样品在色谱柱上的分离情况。
5 其他试剂与仪器：包括样品制备所需的试剂、色谱仪、注射器、进样针等。
1 样品制备：将多糖样品溶解在适当的溶剂中，制备成一定浓度的溶液，以便进行后续分析。
2 色谱条件优化：通过预实验，优化色谱条件，包括流动相的选择、流速、柱温等，以获得最佳的分离效果。
3 进样与分离：将制备好的多糖样品溶液通过注射器注入HPGPC 仪中，通过色谱柱进行分离。
在分离过程中，利用检测器监测多糖样品的分离情况。
4 数据收集与处理：收集分离过程中的数据，利用相应软件对数据进行处理和分析，包括分子量计算、纯度分析等。
5 结果评价：根据分析结果，评价多糖样品的纯度及分子量分布情况，为后续研究提供依据。
通过以上实验材料与方法，可以高效地进行多糖纯度及分子量的测定，为后续多糖的结构研究、质量控制等提供重要支持。
三、实验结果与讨论在本研究中，我们采用了高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）对多糖样品的纯度和分子量进行了测定。
凝胶渗透色谱PPT课件
校正曲线法 逐一注入聚合物标样以确定分子量与保留时间的关系。
ID Time (min)
Mw
1
14.797 853000
2
15.559 380000
3
16.239 186000
4
16.888 100000
5
17.476 48000
6
18.032 23700
7
18.495 12200
8
19.005 5800
样品分子量应处在排阻极限和渗透极限范围内，并且最好是处在校 正曲线线性范围内。
载体是GPC产生分离作用的关键。
18
第18页/共44页
7.6.1 GPC仪器配置 GPC 仪器对载体的要求： 1. 良好的化学稳定性和热稳定性； 2. 有一定的机械强度； 3. 不易变形; 4. 流动阻力小； 5. 对试样没有吸附作用； 6. 分离范围越大越好（取决于孔径分布)等； 7. 载体的粒度愈小，愈均匀，堆积的愈紧密，色谱柱分离效率愈高。
23
第23页/共44页
7.6.3 标样 GPC标样配制
由于凝胶色谱中浓度检测通常使用示差折光检测器，灵敏度不太高，所以试 样的浓度不能配制得太稀。
但另一方面色谱柱的负荷量是有限的，浓度太大易发生“超载”现象。 分子量与样品浓度关系： 低于5千 <1.0%; 5千～2.5万 <0.5%; 2.5万～20万 <0.25%; 20万～200万 <0.1%; 高于200万 <0.05%
为什么要用GPC方法？ 相对分子量分布(多分散性指数)对聚合物的性质有重要影响。经典方法
不能同时测定聚合物的相对分子量及其分布。 凝胶渗透色谱(GPC)的应用改善了测试条件，并提供了可同时测定聚
GPC法测定聚合物分子量和分子量分布
25.00
26.00
27.00
图8 样品的GPC曲线
28.00
29.00
30.00
思考题
色谱柱是如何将高聚物分级的？影响柱效的
因素有哪些？
本实验中校准曲线的线性关系，在色谱柱重
装或换色谱柱时能否再使用？
列出实验测定时某些可能的误差，对分子量
的影响如何？
同样分子量样品支化的和线性的分子哪个先
布的操作步骤。
4. 学会用Breeze软件分析聚合物的分子量和
分子量分布。
实验原理
聚合物的分子量的特点：
大且具有不均一性 (多分散性)。
根据统计方法不同，可分为：
数均分子量 （ ）
重均分子量（ ）
Z 均分子量（ ）
粘均分子量（ ）
聚合物分子量分布情况由多分散性系数表示：
PDI =
实验步骤
操作步骤
检查流动相瓶中THF体积
开机，平衡基线
进样测试
停止测试，关机
数据分析
利用Breeze软件对数据进行处理，得到待测物
的分子量和分子量分布曲线。
167745
30.00
20.00
MV
10.00
0.00
-10.00
18.00
19.00
20.00
21.00
22.00
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凝胶渗透色谱（GPC）法测定聚合物
分子量及分子量分布
主要内容
实验目的
实验原理
实验仪器
实验步骤
数据分析
思考题
实验报告要求
实验目的
1. 了解GPC法测定聚合物分子量及分子量分
用高效凝胶渗透色谱法测定多糖分子量
用高效凝胶渗透色谱法测定多糖分子量
高效凝胶渗透色谱法是一种常用于测定多糖分子量的方法。
以下是其基本步骤：
1. 准备仪器和试剂：高效凝胶渗透色谱仪、色谱柱、流动相（如0.1mol/L的NaCl溶液）、样品溶液（多糖溶液）。
2. 安装色谱柱：将色谱柱安装到高效凝胶渗透色谱仪中，确保密封良好。
3. 流动相的准备：根据需要，将0.1mol/L的NaCl溶液稀释到适当的浓度，作为流动相。
4. 样品溶液的准备：将多糖样品溶解在适量的水中，制备成一定浓度的样品溶液。
5. 测定分子量：将样品溶液加入到高效凝胶渗透色谱仪中，通过流动相进行洗脱。
在洗脱过程中，不同分子量的多糖会根据其大小通过凝胶孔径，从而被分离。
通过记录不同时间点的洗脱体积，可以绘制出多糖的洗脱曲线。
6. 计算分子量：根据洗脱曲线的斜率和截距，可以计算出多糖的分子量。
需要注意的是，高效凝胶渗透色谱法测定多糖分子量时，需要选择合适的凝胶类型和规格，以确保分离效果和准确性。
同时，流动相的选择和浓度也会影响分离效果和测定结果。
因此，在实验过程中需要仔细选择和调整实验条件。
凝胶色谱实验讲义
凝胶渗透色谱在聚合物研究中的应用一、目的要求1. 掌握凝胶渗透色谱（GPC，gel permeation chromatography）的工作原理并了解其构造。
2. 掌握凝胶渗透色谱仪的基本操作及数据处理方法。
3. 利用凝胶渗透色谱仪测定聚合物的分子量及其分布。
二、原理及仪器构造1.凝胶渗透色谱的工作原理。
GPC是一种特殊的液相色谱，所用仪器与高效液相色谱仪类似，但是其色谱柱中的填充相与液相色谱不同，其填充相是具有不同比表面积，孔径分布和孔容的凝胶填料（如葡萄糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯凝胶、琼脂糖凝胶等）。
GPC的分离过程是基于分子筛效应而进行的。
聚合物中分子量小的分子在溶液中的流体力学体积较小因而能够在凝胶颗粒内的孔隙中自由地扩散，但随着分子量的增加其在溶液中的流体力学体积也逐渐增大，当增大到与凝胶中孔隙的尺寸大小相当时，便不能顺利进入到凝胶的内部，分子量更大时便完全不能扩散到凝胶颗粒的内部。
如图1所示：根据这一分子筛效应，可以按照分子尺寸大小的差别来进行分离，而有机聚合物的分子尺寸大小又与分子量成图1正相关，也就是说根据这一效应可以将聚合物分子按照分子量大小的差别来进行分离。
当一个聚合物样品被注入色谱柱时，试样溶液流经凝胶固定相颗粒，其中分子尺寸较大的不能进入凝胶孔隙，既被固定相排斥。
因此这些分子便直接流出色谱柱，而他们的色谱峰便最先在色谱图上出现。
另外，样品中尺寸最小的分子则能够进入固定相中所有的孔隙并浸入到整个颗粒内部，于是它们通过色谱柱最慢，保留时间最长，其色谱峰在谱图上出现最晚，而中等尺寸的分子只能够进入固定相中部分较大的孔隙，因而以中等流速流过色谱柱。
这样便按照分子尺寸的大小，按从大到小的顺序实现了样品中各组分的分离。
如图2所示：图2GPC 的实验方法是先利用同一组分已知分子量的窄分散性（w M /n M ≤1.1）聚合物标准试样，在与未知试样相同的条件下得到一系列GPC 谱图。
凝胶渗透色谱gpc分子量测试
凝胶渗透色谱gpc分子量测试
凝胶渗透色谱（GPC）是一种用于测量分子量和分子尺寸的常用技术。
它基于分子在凝胶中的扩散行为，通过比较不同分子在凝胶中的迁移速率来确定其分子量。
以下是GPC分子量测试的基本步骤：
1. 样品准备：首先，你需要将待测样品溶解在适当的溶剂中。
对于聚合物，常用的溶剂是四氢呋喃（THF）、氯仿或二甲基甲酰胺（DMF）。
确保样品完全溶解并过滤以去除任何杂质。
2. 校准曲线：使用已知分子量的聚合物标准品进行校准。
这些标准品通常具有窄分子量分布，例如聚苯乙烯（PS）或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。
将标准品溶解在相同的溶剂中，并在GPC仪器上进行分析。
根据标准品的保留时间和分子量之间的关系，建立校准曲线。
3. 样品加载：将待测样品加载到GPC柱上。
这可以通过注射器或自动进样器完成。
确保样品在加载过程中不会发生气泡形成或其他污染。
4. 分离和检测：将样品溶液通过GPC柱，柱子中的凝胶会选择性地吸附和分离不同大小的分子。
流动相（通常是溶剂）以恒定的流速通过柱子，使分子逐渐分离。
分离后的分子通过检测器进行检测，常用的检测器是折射率检测器、紫外可见光检测器或示差折光检测器。
5. 数据分析：根据校准曲线和样品的保留时间，可以计算出样品的分子量。
GPC软件通常会提供分析结果，包括分子量分布图、平均分子量等。
需要注意的是，GPC测试的结果受到许多因素的影响，如样品浓度、溶剂选择、柱类型和温度等。
因此，在进行GPC测试时，需要仔细控制实验条件，并遵循标准操作程序。
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实验六 凝胶渗透色谱法测定分子量聚合物分子量具有多分散性，即聚合物的分子量存在分布。
不同的聚合方法、聚合工艺会使聚合物具有不同的分子量和分子量分布。
分子量对聚合物的性能有十分密切的关系。
而分子量分布的影响也不可忽视。
当今高分子材料已向高性能化发展，类似分子量分布等高一层次的高分子结构的问题，越来越引起人们的重视。
自高分子材料问世以来，人们不断探索分子量分布的测定方法。
直到60年代凝胶渗透色谱诞生。
成为迄今为止最为有效的分子量分布的测定方法。
三十多年来，凝胶渗透色谱技术得到了很大的发展，表现在色谱柱体积减小而分离效率提高；检测器精度提高。
在线分子量检测技术得到应用；并随着计算机的发展，数据处理得快速、精确、信息量增加也更趋明显。
一、实验目的：1． 了解凝胶渗透色谱的原理；2． 了解凝胶渗透色谱的仪器的构造和凝胶渗透色谱的实验技术；3． 测定聚苯乙烯样品的分子量分布。
二、实验原理：凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography.简称GPC ）也称为体积排除色谱（Size Exclution Chromatograph.简称SEC ）是一种液体（液相）色谱。
和各种类型的色谱一样，GPC/SEC 的作用也是分离，其分离对象是同一聚合物中不同分子量的高分子组分。
当样品中不同分子量的高分子组分的分子量和含量被确定，也就找到了聚合物的分子量分布，然后可以很方便地对分子量进行统计，得到各种平均值。
一般认为，GPC/SEC 是根据溶质体积的大小，在色谱中体积排除效应即渗透能力的差异进行分离。
高分子在溶液中的体积决定于分子量、高分子链的柔顺性、支化、溶剂和温度，当高分子链的结构、溶剂和温度确定后，高分子的体积主要依赖于分子量。
凝胶渗透色谱的固定相是多孔性微球，可由交联度很高的聚苯乙烯、聚丙烯酸酰胺、葡萄糖和琼脂糖的凝胶以及多孔硅胶、多孔玻璃等来制备。
色谱的淋洗液是聚合物的溶剂。
当聚合物溶液进入色谱后，溶质高分子向固定相的微孔中渗透。
由于微孔尺寸与高分子的体积相当，高分子的渗透几率取决于高分子的体积，体积越小渗透几率越大，随着淋洗液流动它在色谱中走过的路程就越长，用色谱术语就是淋洗体积或保留体积增大。
反之，高分子体积增大，淋洗体积减小，因而达到依高分子体积进行分离的目的。
基于这种分离机理，GPC/SEC 的淋洗体积是有极限的。
当高分子体积增大到已完全不能向微孔渗透，淋洗体积趋于最小值，为固定相微球在色谱中的粒间体积。
反之，当高分子体积减小到对微孔的渗透几率达到最大时，淋洗体积趋于最大值，为固定相的总体积与粒间体积之和，因此只有高分子的体积居两者之间，色谱才会有良好的分离作用。
对一般色谱分辨率和分离效率的评定指标，在凝胶渗透色谱中也延用。
色谱需要检测淋出液中的含量，因聚合物的特点，GPC/SEC 最常用的是示差折光指数检测器。
其原理是利用溶液中溶剂（淋洗液）和聚合物的折光指数具有加和性，而溶液折光指数随聚合物浓度的变化量c n ∂∂/值一般为常数，因此可以用溶液和纯溶剂折光指数之差（示差折光指数）n ∆作为聚合物浓度的响应值。
对于带有紫外线吸收基团（如苯环）聚合物，也可以用紫外吸收检测器，其原理是根据比儿定律吸光度与浓度成正比，用吸光度作为浓度的响应值。
图6-1是GPC/SEC 的构造示意图，淋洗液通过输液泵成为流速恒定的流动相，进入紧密装填多孔性微球的色谱柱，中间经过一个可将溶液样品送往体系的进样装置。
聚合物样品进样后，淋洗液带动溶液样品进入色谱柱并开始分离，随着淋洗液的不断洗提，被分离的高分子组分陆续从色谱柱中淋出。
浓度检测器不断检测淋洗液中高分子组分的浓度响应，数据被记录最后得到一张完整的GPC/SEC 淋洗曲线。
如图6-2。
图6-1 GPC/SEC 的构造图6-2 GPC/SEC 淋洗曲线和“切割法”淋洗曲线表示GPC/SEC 对聚合物样品依高分子体积进行分离的结果，并不是分子量分布曲线。
好在实验证明淋洗体积和聚合物分子量有如下关系：lnM=A —BVe 或 logM=A ˊ—B ˊV (1)式中M 为高分子组分的分子量，A 、B （或A ˊ、B ˊ）与高分子链结构、支化以及溶剂温度等影响高分子在溶液中的体积的因素有关，也与色谱的固定相、 体积和操作条件等仪器因素有关，因此（1）式称为GPC/SEC 的标定（校正）关系。
（1）式的适用性还限制在色谱固定相渗透极限以内，也就是说分子量过高或太低都会使标定关系偏离线性。
一般需要用一组已知分子量的窄分布的聚合物标准样品（标样）对仪器进行标定，得到在指定实验条件，适用于结构和标样相同的聚合物的标定关系。
GPC/SEC 的数据处理，一般采纳用“切割法。
在谱图中确定基线后，基线和淋洗曲线所包围的面积是被分离后的整个聚合物，依横坐标对这块面积等距离切割。
切割的含义是把聚合物样品看成由若干个具有不同淋洗体积的高分子组分所组成，每个切割块的归一化面积（面积分数）是高分子组分的含量，切割块的淋洗体积通过标定关系可确定组分的分子量，所有切割块的归一化面积和相应的分子量列表或作图，得到完整的聚合物样品的分子量分布结果。
因为切割是等距离的，所以用切割块的归一化高度就可以表示组分的含量。
切割密度会影响结果的精度，当然越高越好，但一般认为，一个聚合物样品切割成20块以上，对分子量分布描述的误差已经小于GPC/SEC 方法本身的误差，当用计算机记录、处理数据时，可设定切割成近百块。
用分子量分布数据，很容易计算各种平均分子量，以n M 和W M 为例：1(/)/()i n i i i i i i iH M W M H M -==∑∑∑ （2）/W i i i i i i i iM W M H M H ==∑∑∑ （3）式中，Hi 是切割块的高度。
实际上GPC/SEC 的标定是困难的，因为聚合物标样来之不易。
商品标样品种不多且价格昂贵，一般只用聚苯乙烯标样，但聚苯乙烯的标定关系并不适合其他聚合物。
研究者从分离机理和高分子体积与分子量的关系，发现了GPC/SEC 的普适校正关系：㏑M[η]=Au-B u Ve 或logM[η]=A u ˊ、-B u ˊ、Ve （4）式中[η]是高分子组分的特性粘数，A u 、、B u （或A u ˊ、B u ˊ）为常数，与（1）式不同这两个常数不再和高分子链结构、支化有关，（4）式中为仅与仪器、实验条件有关而对大部分聚合物普适的校正关系。
[η]可用Mark-Houwink 方程代人，通过手册查找常数K 、α。
但是，不少聚合物在GPC/SEC 常用溶剂和实验温度下的K 、α值并没有报导，即使能够查到，其准确性也很难判断，因此利用普适校正关系还是受到很大的限制。
GPC/SEC 的分子量在线检测技术，从根本上解决了分子量标定问题。
目前技术比较成熟的是光散射和特性粘数检测顺，前者检测淋洗液的瑞利比，直接得到高分子组分的分子量；后者则检测淋洗液的特性粘数，利用普适校正关系来确定组分的分子量。
此外，利用分子量响应检测器，还能得有关高分子结构的其他信息，使凝胶渗透色谱的作用进一步加强。
三、仪器与试剂:1、组合式GPC/SEC 仪（美国Waters 公司），分析天平、13mm 微孔过滤器；2、淋洗液（溶剂）：四氢呋喃（AR ），重蒸后用0.45μm 孔径的微孔滤膜过滤；3、被测样品：悬浮聚合的聚苯乙烯；4、标准样品：分子量窄分布的聚苯乙烯；5、器皿：配样瓶，注射针筒。
四、实验步骤:1、 样品配制选取十个不同分子量的标样， 按分子量顺序1、3、5、7、9和2、4、6、8、10分为两组，每组标样分别称取约2mg 混在一个配样瓶中，用针筒注入约2ml 溶剂，溶解后用装有0.45μm 孔径的微孔滤膜的过滤器过滤；在配样瓶中称取约4mg 被测样品，注入约2ml 溶剂，溶解后过滤。
2、 仪器观摩了解GPC/SEC 仪各组成部分的作用和大致结构，了解实验操作要点。
接通仪器电源，设定淋洗液流速为1.0ml/min 、柱温和检测温度为30℃。
了解数据处理系统的工作过程，但本实验将数据处理系统仅用作记录仪，数据处理由人工完成，以便加深对分子量分布的概念和GPC/SEC 的认识。
3、 GPC/SEC 的标定待仪器基线稳定后，用进样针筒先后将两个混合标样溶液进样，进样量为100μl ，等待色谱淋洗，最后得到完整的淋洗曲线。
从两张淋洗曲线确定共十个标样的淋洗体积。
4、 样品测定同上法，将样品溶液进样，得到淋洗曲线后，确定基线，用“切割法”进行数据处理，切割块数应在20以上。
五、数据处理：1、 GPC/SEC 的标定标样浓度 淋洗液 流速色谱柱 柱温 进样量标样序号 分子量 淋洗体积 12…作logM-V e 图得GPC/SEC 标定关系2、 样品测定样品 浓度 淋洗液 流速色谱柱 柱温 进样量切割块号I V ei Hi Mi HiMi Hi/Mi123……计算i i H∑、i i i H M ∑和(/)i i i H M ∑，根据（2）、（3） 式算出样品的数均和重均分子量，并计算多分散系数/W n d M M =。
六、思考题：1、高分子的链结构、溶剂和温度为什么会影响凝胶渗透色谱的校正关系？2、为什么在凝胶渗透色谱实验中，样品溶液的浓度不必准确配制？参考文献[1]施良和.凝胶色谱法.科学出版社,1980.[2]郑昌仁.高聚物分子量及其分布.科学出版社,1986.[3]成跃祖.凝胶渗透色谱法的进展及其应用.中国石化出版社,1983.。