HPLC中的手性固定相

经典手性固定相
• 蛋白质类手性固定相：
– 最早的基于牛血清白蛋白的色谱柱，曾被成功 用于N-衍生化氨基酸、芳香氨基酸、不带电荷 物等。 – α-酸性糖蛋白类手性固定相则被报道用于青霉 胺类对映体的制备和分析。
– 基于人血清白蛋白的手性固定相，则被用于分 离布洛芬、酮洛芬和苯并二氮杂卓类药物的分 析。
经典手性固定相
• 人工合成多聚体型手性固定相：
– 通过模仿天然多聚物的手性识别原理，某些人工合成 的化学物质也成功具备了天然多聚物的手性识别能力。 人工合成多聚物具有高柱容量、高柱效和对流动相的 广泛适应性等优点。 – 有3类不同的多聚物被使用，分别是加聚物、缩聚物和 交联聚合物。螺旋状聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺和聚甲 基丙烯酰胺、聚烯烃、聚苯乙烯衍生物、聚乙烯基醚、 聚醚等都曾被用于手性分析。 – 基于分子印迹技术得到的采用模板聚合方式的交联胶 类，因为其所具有的诸多优点，如易于制备、易于扩 展、低成本、稳定性和相对于溶剂的广泛适用性，而 尤其受人关注。
经典手性固定相
• 环糊精型手性固定相：
– 多类化合物通过环糊精得以成功完成手性分离，如β-阻 断剂、生物碱、羧酸及其他中性分子等。 – β-阻断剂类药物，可以直接在天然β-环糊精或γ-环糊精 固定相上分离。 – 将环糊精进行磺基化后，可以利用其多重相互作用 （如疏水性或静电力），分离中性物质、阴离子或阳 离子，该类手性固定相在生物医药领域的应用非常广 泛。 – 氨基甲酰化或二醇化的环糊精固定相，用于分离环己 烯巴比妥、氯苯吡胺（扑尔敏）等
经典手性固定相
• 人工合成多聚体型手性固定相：
经典手性固定相
• 人工合成多聚体型手性固定相：
– 通过交联聚合凝胶得到的具有手性识别能力空洞的分 子印迹手性固定相，最早见于1972年。 – 分子印迹多聚物的制备，常被分为2部分（功能性单体 的聚合反应和围绕印迹分子的交联单体聚合反应，微 粒的磨碎及被印迹分子的提取）。最被广泛使用的功 能性单体是甲基丙烯酸，而最普遍使用的交联单体是 乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）。 – 分子印迹聚合物用作手性固定相还面临着制备出一致 性、均匀性和稳定性固定相颗粒方面的诸多问题，而 且该类固定相还存在传质阻力大而导致的分离效能问 题。
经典手性固定相
• 多糖类手性固定相：
– 在2003年统计的文献中，85%的手性HPLC使用多糖类 手性固定相；而2005年的文献统计中，90%的手性 HPLC固定相为多糖类。 – 大约200种不同的基于纤维素、直链淀粉、几丁质、壳 聚糖、半乳糖胺、凝乳、右旋糖酐、木聚糖和菊糖等 的衍生物被用于制备具有手性识别能力的HPLC固定相。 纤维素和直链淀粉衍生物，体现了更高的手性识别能 力，尤其是苯基氨基甲酸酯和安息香酸酯类衍生物。 – 1970年，微晶纤维素三醋酸酯成为第一个被用于实践 的多糖类手性固定相，并在1984年采用表面涂覆在大 孔二氧化硅基质上的方式，制备了首个商品化多糖类 手性固定相。
经典手性固定相
• 多糖类手性固定相：
经典手性固定相
• 蛋白质类手性固定相：
– 用于手性分析的蛋白质，通常都来源于自然界。由于 氨基酸的排列顺序和糖基化程度的不同，蛋白质具有 不同的三维结构，并在三维结构的不同位点上，存在 着各类相互作用的位点，这一结构特点是蛋白质具备 手性识别能力的主因。 – 牛血清白蛋白是最早用于手性分离的蛋白质，之后出 现了固定化的牛血清白蛋白和α-酸性糖蛋白HPLC固定 相。 – 尽管易于获得，蛋白质类手性固定相存在载样量小、 低分离效能、容易变性等特点，同时其流动相的pH值、 离子强度和有机相组成等也受到限制。
经典手性固定相
• 环糊精型手性固定相：
– 环糊精从1970年代开始被尝试用于手性分离。 – 环糊精是一类由环形低聚糖构成的杯状化合物， 通常由淀粉经环糊精转糖基酶催化得来，含有 6（α-环糊精）、7（β-环糊精）或8（γ-环糊精） 个经α-（1,4）-糖苷键连接而得到的吡喃型葡 萄糖单位。 – 环糊精杯状结构的腔内部，不含有羟基，呈疏 水性，而杯状的外沿则是亲水性的。
经典手性固定相
• 人工合成多聚体型手性固定相：
– 通过加聚反应制备的含手性基团的线性聚合单 螺旋聚丙烯酸酯和聚（甲基）丙烯酰胺，是这 类手性固定相的主要代表，最早的该类手性固 定相是1979年合成的单螺旋三苯甲基-甲基丙 烯酸酯。 – 螺旋形是该类固定相产生手性识别能力的主要 原因，碳水化合物、醚类、胺类、卤化物和有 机含磷化合物都有在该类固定相上分离的成功 例子。
经典手性固定相
• 环糊精型手性固定相：
经典手性固定相
• 环糊精型手性固定相：
– 大多数环糊精手性固定相只适用于反相色谱， 分析极性有机化合物。
– 部分改性后的环糊精手性固定相可以被用于正 相色谱，如Cyclobond I RN或SN，因其可作为 π电子供体，具有π电子接受能力的被分析物可 以正相色谱的方式保留在这种手性固定相上。
经典手性固定相
• 冠醚类手性固定相：
– 冠醚手性固定相主要用于分离含初级胺基手性中心的 物质，如氨基酸及其衍生物。主要有2种冠醚类固定相 被广泛应用，而且有商品化的供应，如下表。 – 一个结合了3,3’-联苯-1,1’-联萘，其他的结合了酒石酸。 前者曾被用于分离α-氨基酸、1-苯基-乙胺及3-氨基己 内酰胺、β-氨基酸、芳基-α-氨基酮及氟代喹诺酮等， 而后者则被用于分离α-氨基酸、丙氨酸-β-萘胺、氨基 醇、1-（1-ห้องสมุดไป่ตู้基）乙胺、α-甲基-色胺等。
概述
• 常见商业来源的HPLC中手性固定相的主要结构、 识别机理、限制与应用，将是本节主要内容。 • 经典的手性固定相通常被分为配基交换、环糊精、 Pirkle型、合成多聚物、多糖、蛋白质、大环抗生 素和冠醚类。除此之外，还有许多其他的具有潜 在发展前景的手性固定相，但还未达到前述的商 业化程度，如环果聚糖、金属复合物、硼包含物 等。 • 色谱手性分离技术的合理设计，以及基于高通量 筛选与计算化学的新技术在HPLC手性固定相研 制中，极有可能成为未来发展的方向。
经典手性固定相
• 大环抗生素类手性固定相：
– 大环抗生素类光谱特性使得其可适应几乎所有 的色谱模式。
– 安莎霉素类和糖肽类是使用最多的手性选择体。
经典手性固定相
• 冠醚类手性固定相：
– 冠醚最早用于1967年，是一种大环聚醚，其分子立体 结构中具有一个特定大小的空腔。冠醚结构上的氧， 作为受电子基团，分布在空腔的内侧壁，使得金属或 铵离子可以进入到该空腔内。 – 1979年，有人将双（1,19-联萘）-22-冠-6固定化到聚 苯乙烯和硅胶基体上，得到首个基于冠醚的手性 固定 相。 – 通过将多种手性芳香环连接到冠醚骨架上形成手性屏 障，可以得到多种手性冠醚，如含联萘、联菲单位、 手性螺旋衍生，以及某些自然产生的手性分子，如酒 石酸或碳水化合物。
经典手性固定相
• Pirkle型手性固定相：
– 由于Pirkle型固定相的主要相互作用是π-π相互 作用，因而其主要用于分离含芳香基团的对映 体。 – Pirkle型固定相大都适用于正相HPLC。 – 大多Pirkle型固定相用于分离氨基酸、氨基醇、 胺类及某些酸性手性化合物时，可得到较好的 拆分能力。
经典手性固定相
• 环糊精型手性固定相：
– 环糊精类的手性识别能力，不仅与外沿的亲水 性基团有关，而且与被分析物的疏水性基团 （尤其是芳香疏水基团）被杯腔包含有关。 – 在环糊精杯腔外沿的C-2、C-3上的羟基，差异 性产生氢键、偶极-偶极作用，也是手性识别的 因素。通过对羟基进行化学改性，可以增强环 糊精的手性分离能力。 – β-环糊精是HPLC中使用最多的手性分离物质。
经典手性固定相
• Pirkle型手性固定相：
– Pirkle型手性固定相最早于1970年代末由Pirkle课题组 研制。该类手性固定相是将小分子手性选择物质键合 到固体载体（如硅胶）上得到，通常被称作Pirkle型、 刷型或π电子给予或π电子接受型手性固定相。 – 刷型固定相的手性分子主要分布在惰性基质的表面， 容易接触到被分析物质。在被分离物与固定相间的主 要相互作用是π-π相互作用，同时也存在其他类型的相 互作用，如氢键、偶极-偶极作用、空间位阻等。 – 由于良好的载样能力，Pirkle型固定相非常适用于临床 前少量药物的HPLC手性分离制备。
经典手性固定相
• 多糖类手性固定相：
– 该类手性固定相可以通过连接各种取代基团到 羟基上，而得到各种不同手性识别能力的 HPLC固定相。 – 该类物质的手性识别能力，被归因到具有手性 的碳水化合物单体及其很长的螺旋形二级结构。 – 多糖含有众多的可能作用位点，因而可用于分 析种类众多的待测物。多糖使用非常广泛，在 所有手性固定相中，其可分离物质的种类仅次 于蛋白质，但其载样量远大于蛋白质类固定相。
经典手性固定相
• 配体交换型手性固定相：
经典手性固定相
• 配体交换型手性固定相：
– 配体结合型的手性固定相主要用于生物相关性 物质的手性分离，如氨基酸和羟基酸。只有那 些具有2个或以上可供螯合的基团的对映体， 才能在这一类固定相上分离。 – 常见的金属离子，有Cu（II）、Zn（II）、Ni （II）等，其中以Cu（II）为多用，Zn（II）分 离含羟基的氨基酸效果最好。 – 如分子结构中含有芳香基团或杂原子时，分离 情况会有所不同。
经典手性固定相
• 大环抗生素类手性固定相：
– 1994年，大环抗生素类首次作为手性固定相，用于分 离氨基酸类对映体。大环抗生素类手性固定相也是常 用固定相之一，次于多糖类和环糊精类。
– 与其他手性选择体不同，大环抗生素类在结构上具有 显著的多样性，如大环多烯-多羟基化合物、柄状化合 物、大环糖肽、多肽和肽杂环类化合物。结构上的多 样性，使得该类固定相有可能提供多种相互作用方式， 如疏水作用、偶极-偶极作用、π-π相互作用、氢键连 接及立体位阻等。