生物化学课后答案3核酸

3 核酸
1．①电泳分离四种核苷酸时，通常将缓冲液调到什么pH？此时它们是向哪极移动？移动的快慢顺序如何? ②将四种核苷酸吸附于阴离子交换柱上时，应将溶液调到什么pH？
③如果用逐渐降低pH的洗脱液对阴离子交换树脂上的四种核苷酸进行洗脱分离，其洗脱顺序如何？为什么？
解答：①电泳分离4种核苷酸时应取pH3.5 的缓冲液，在该pH时，这4种单核苷酸之间所带负电荷差异较大，它们都向正极移动，但移动的速度不同，依次为：UMP>GMP>AMP>CMP；②应取pH8.0，这样可使核苷酸带较多负电荷，利于吸附于阴离子交换树脂柱。

虽然pH 11.4时核苷酸带有更多的负电荷，但pH过高对分离不利。

③当不考虑树脂的非极性吸附时，根据核苷酸负电荷的多少来决定洗脱速度，则洗脱顺序为CMP>AMP> GMP > UMP，但实际上核苷酸和聚苯乙烯阴离子交换树脂之间存在着非极性吸附，嘌呤碱基的非极性吸附是嘧啶碱基的3倍。

静电吸附与非极性吸附共同作用的结果使洗脱顺序为：CMP> AMP > UMP >GMP。

2．为什么DNA不易被碱水解，而RNA容易被碱水解?
解答：因为RNA的核糖上有2'-OH基，在碱作用下形成2',3'-环磷酸酯，继续水解产生2'-核苷酸和3'-核苷酸。

DNA的脱氧核糖上无2'-OH基，不能形成碱水解的中间产物，故对碱有一定抗性。

3．一个双螺旋DNA分子中有一条链的成分[A] = 0.30，[G] = 0.24，①请推测这一条链上的[T]和[C]的情况。

②互补链的[A]，[G]，[T]和[C]的情况。

解答：①[T] + [C] = 1–0.30–0.24 = 0.46；②[T] = 0.30，[C] = 0.24，[A] + [G] = 0.46。

4．对双链DNA而言，①若一条链中(A + G)/(T + C)= 0.7，则互补链中和整个DNA分子中(A+G)/(T+C)分别等于多少？②若一条链中(A + T)/(G + C)= 0.7，则互补链中和整个DNA分子中(A + T)/(G + C)分别等于多少？
解答：①设DNA的两条链分别为α和β则：Aα= Tβ，Tα= Aβ，Gα= Cβ，Cα= Gβ，因为：(Aα+ Gα)/（Tα+ Cα）= (Tβ+ Cβ)/（Aβ+ Gβ）= 0.7，所以互补链中（Aβ+ Gβ）/（Tβ+ Cβ）= 1/0.7 =1.43；在整个DNA分子中，因为A = T，G = C，所以，A + G = T + C，（A + G）/（T + C）= 1；②假设同（1），则Aα+ Tα= Tβ+ Aβ，Gα+ Cα= Cβ+ Gβ，所以，（Aα+ Tα）/（Gα+ Cα）=（Aβ+ Tβ）/（Gβ+ Cβ）= 0.7 ；在整个DNA分子中，（Aα+ Tα+ Aβ+ Tβ）/（Gα+Cα+ Gβ+Cβ）= 2（Aα+ Tα）/2（Gα+Cα）= 0.7
5．T7噬菌体DNA(双链B-DNA)的相对分子质量为2.5×107，计算DNA链的长度(设核苷酸对的平均相对分子质量为640)。

解答：0.34 ×（2.5×107/640）= 1.3 × 104nm = 13μm。

6．如果人体有1014个细胞，每个体细胞的DNA含量为6.4 × 109个碱基对。

试计算人体DNA的总长度是多少？是太阳―地球之间距离(2.2 × 109 km)的多少倍？已知双链DNA
每1000个核苷酸重1 ×10-18g，求人体DNA的总质量。

解答：每个体细胞的DNA的总长度为：6.4 × 109 × 0.34nm = 2.176 × 109 nm = 2.176m，人体内所有体细胞的DNA的总长度为：2.176m×1014 = 2.176×1011km，这个长度与太阳―地球之间距离（2.2×109 km）相比为：2.176 × 1011/2.2 × 109 = 99倍，每个核苷酸重1 × 10-18g/1000 = 10-21g，所以，总DNA 6.4 × 1023 × 10-21 = 6.4 × 102 = 640g。

7．有一个X噬菌体突变体的DNA长度是15μm，而正常X噬菌体DNA的长度为17μm，计算突变体DNA中丢失掉多少碱基对？
解答：（17–15）×103/0.34 = 5.88 ×103bp
8．概述超螺旋DNA的生物学意义。

解答：①超螺旋DNA比松弛型DNA更紧密，使DNA分子的体积更小，得以包装在细胞内；②超螺旋会影响双螺旋分子的解旋能力,从而影响到DNA与其他分子之间的相互作用；③超螺旋有利于DNA的转录、复制及表达调控。

9．为什么自然界的超螺旋DNA多为负超螺旋？
解答：环状DNA自身双螺旋的过度旋转或旋转不足都会导致超螺旋，这是因为超螺旋将使分子能够释放由于自身旋转带来的应力。

双螺旋过度旋转导致正超螺旋，而旋转不足将导致负超螺旋。

虽然两种超螺旋都能释放应力，但是负超螺旋时，如果发生DNA解链（即氢链断开，部分双螺旋分开）就能进一步释放应力，而DNA转录和复制需要解链。

因此自然界环状DNA采取负超螺旋，这可以通过拓扑异构酶的操作实现。

10．真核生物基因组和原核生物基因组各有哪些特点?
解答：不同点:①真核生物DNA含量高，碱基对总数可达10 11，且与组蛋白稳定结合形成染色体，具有多个复制起点。

原核生物DNA含量低，不含组蛋白，称为类核体，只有一个复制起点。

②真核生物有多个呈线形的染色体；原核生物只有一条环形染色体。

③真核生物DNA中含有大量重复序列，原核生物细胞中无重复序列。

④真核生物中为蛋白质编码的大多数基因都含有内含子(有断裂基因)；原核生物中不含内含子。

⑤真核生物的RNA 是细胞核内合成的，它必须运输穿过核膜到细胞质才能翻译，这样严格的空间间隔在原核生物内是不存在的。

⑥原核生物功能上密切相关的基因相互靠近，形成一个转录单位，称操纵子，真核生物不存在操纵子。

⑦病毒基因组中普遍存在重叠基因，但近年发现这种情况在真核生物也不少见。

相同点:都是由相同种类的核苷酸构成的的双螺旋结构，均是遗传信息的载体，均含有多个基因。

11．如何看待RNA功能的多样性?它的核心作用是什么?
解答：RNA的功能主要有:①控制蛋白质合成；②作用于RNA转录后加工与修饰；
③参与细胞功能的调节；④生物催化与其他细胞持家功能；⑤遗传信息的加工；⑥可能是生物进化时比蛋白质和DNA更早出现的生物大分子。

其核心作用是既可以作为信息分子又可以作为功能分子发挥作用。

12．什么是DNA变性？DNA变性后理化性质有何变化？
解答：DNA双链转化成单链的过程称变性。

引起DNA变性的因素很多，如高温、超声波、强酸、强碱、有机溶剂和某些化学试剂（如尿素，酰胺)等都能引起变性。

DNA变性后的理化性质变化主要有：①天然DNA分子的双螺旋结构解链变成单链的无规则线团，生物学活性丧失；②天然的线型DNA分子直径与长度之比可达1∶10，其水溶液具有很大的黏度。

变性后，发生了螺旋-线团转变，黏度显著降低；③在氯化铯溶液中进行密度梯度离心，变性后的DNA浮力密度大大增加，故沉降系数S增加；④DNA变性后，碱基的有序堆积被破坏，碱基被暴露出来，因此，紫外吸收值明显增加，产生所谓增色效应。

⑤DNA分子具旋光性，旋光方向为右旋。

由于DNA分子的高度不对称性，因此旋光性很强，其[a] = 150。

当DNA分子变性时，比旋光值就大大下降。

13．哪些因素影响T m值的大小？
解答：影响T m的因素主要有：①G-C对含量。

G-C对含3个氢键，A-T对含2个氢键，故G-C对相对含量愈高，T m亦越高（图3-29）。

在0.15mol/L NaCl,0.015mol/L柠檬酸钠溶液(1×SSC)中，经验公式为：（G+C）% =（T m- 69.3）×2.44。

②溶液的离子强度。

离子强度较低的介质中，T m较低。

在纯水中，DNA在室温下即可变性。

分子生物学研究工作中需核酸变性时，常采用离子强度较低的溶液。

③溶液的pH。

高pH下，碱基广泛去质子而丧失形成氢键的有力，pH大于11.3时，DNA完全变性。

pH低于5.0时，DNA易脱嘌呤，对单链DNA进行电泳时，常在凝胶中加入NaOH以维持变性关态。

④变性剂。

甲酰胺、尿素、甲醛等可破坏氢键，妨碍碱堆积，使T m下降。

对单链DNA进行电泳时，常使用上述变性剂。

14．哪些因素影响DNA复性的速度？
解答：影响复性速度的因素主要有：①复性的温度，复性时单链随机碰撞，不能形成碱基配对或只形成局部碱基配对时，在较高的温度下两链重又分离，经过多次试探性碰撞才能形成正确的互补区。

所以，核酸复性时温度不宜过低，T m-25℃是较合适的复性温度。

②单链片段的浓度，单链片段浓度越高，随机碰撞的频率越高，复性速度越快。

③单链片段的长度，单链片段越大，扩散速度越慢，链间错配的概率也越高。

因面复性速度也越慢，即DNA的核苷酸对数越多，复性的速度越慢，若以C0为单链的初始浓度，t为复性的时间，复性达一半时的C0t值称C0t1/2，该数值越小，复性的速度越快。

④单链片段的复杂度，在片段大小相似的情况下，片段内重复序列的重复次数越多，或者说复杂度越小，越容易形成互补区，复性的速度就越快。

真核生物DNA的重复序列就是复生动力学的研究发现的，DNA的复杂度越小，复性速度越快。

15．概述分子杂交的概念和应用领域。

解答：在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成双链，或DNA单链和RNA单链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程称分子杂交。

通常对天然或人工合成的DNA或RNA片段进行放射性同位素或荧光标记，做成探针，经杂交后，检测放射性同位素或荧光物质的位置，寻找与探针有互补关系的DNA或RNA。

直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，因未改
变核酸所在的位置，称原位杂交技术。

将核酸直接点在膜上，再与探针杂交称点杂交，使用狭缝点样器时，称狭缝印迹杂交。

该技术主要用于分析基因拷贝数和转录水平的变化，亦可用于检测病原微生物和生物制品中的核酸污染状况。

杂交技术较广泛的应用是将样品DNA 切割成大小不等的片段，经凝胶电泳分离后，用杂交技术寻找与探针互补的DNA片段。

由于凝胶机械强度差，不适合于杂交过程中较高温度和较长时间的处理，Southern 提出一种方法，将电泳分离的DNA片段从凝胶转移到适当的膜（如硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，在进行杂交操作，称Southern印迹法，或Southern杂交技术。

随后，Alwine等提出将电泳分离后的变性RNA吸印到适当的膜上再进行分子杂交的技术，被戏称为 Northern印迹法，或Northern杂交。

分子杂交广泛用于测定基因拷贝数、基因定位、确定生物的遗传进化关系等。

Southern杂交和Northern杂交还可用于研究基因变异，基因重排，DNA多态性分析和疾病诊断。

杂交技术和PCR技术的结合，使检出含量极少的DNA成为可能。

促进了杂交技术在分子生物学和医学领域的广泛应用。

DNA芯片技术也是以核酸的分子杂交为基础的。

16．概述核酸序列测定的方法和应用领域。

解答：DNA的序列测定目前多采用Sanger提出的链终止法，和Gilbert提出的化学法。

其中链终止法经不断改进，使用日益广泛。

链终止法测序的技术基础主要有：①用凝胶电泳分离DNA单链片段时，小片段移动，大片段移动慢，用适当的方法可分离分子大小仅差一个核苷酸的DNA片段。

②用合适的聚合酶可以在试管内合成单链DNA模板的互补链。

反应体系中除单链模板外，还应包括合适的引物，4种脱氧核苷三磷酸和若干种适量的无机离子。

如果在4个试管中分别进行合成反应，每个试管的反应体系能在一种核苷酸处随机中断链的合成，就可以得到4套分子大小不等的片段，如新合成的片段序列为-CCATCGTTGA-，在A 处随机中断链的合成，可得到-CCA和-CCATCGTA两种片段，在G处中断合成可得到-CCATCG 和-CCATCGTTG两种片段。

在C和T处中断又可以得到相应的2套片段。

用同位素或荧光物质标记这4套新合成的链，在凝胶中置于4个泳道中电泳，检测这4套片段的位置，即可直接读出核苷酸的序列。

在特定碱基处中断新链合成最有效的办法，是在上述4个试管中按一定比例分别加入一种相应的2',3'-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），由于ddNTP的3'位无-OH，不可能形成磷酸二酯键，故合成自然中断。

如上述在A处中断的试管内，既有dATP，又有少量的ddATP，新合成的-CCA链中的A如果是ddAMP,则链的合成中断，如果是dAMP，则链仍可延伸。

因此，链中有几个A，就能得到几种大小不等的以A为末端的片段。

如果用放射性同位素标记新合成的链，则4个试管中新合成的链在凝胶的4个泳道电泳后，经放射自显影可检测带子的位置，由带子的位置可以直接读出核苷酸的序列。

采用T7测序酶时，一次可读出400多个核苷酸的序列。

近年采用4种射波长不同的荧光物质分别标记4种不同的双脱氧核苷酸，终止反应后4管反应物可在同一泳道电泳，用激光扫描收集电泳信号，经计算机处理可将序列直接打印出来。

采用毛细管电泳法测序时，这种技术一次可测定700个左右核苷酸的序列，一台仪器可以有几十根毛细管同时进行测序，且电泳时间大大缩短，自动
测序技术的进步加快了核酸测序的步伐，现已完成了包括人类在内的几十个物种的基因组测序。

RNA序列测定最早采用的是类似蛋白质序列测定的片段重叠法，Holley用此法测定酵母丙氨酸tRNA序列耗时达数年之久。

随后发展了与DNA测序类似的直读法，但仍不如DNA 测序容易，因此，常将RNA反转录成互补DNA（cDNA），测定cDNA序列后推断RNA的序列，目前16S rRNA 1 542 b的全序列测定，23S rRNA 2 904 b的全序列测定，噬菌体MS2 RNA 3 569 b的全序列测定均已完成。