酸性α醋酸萘酯酶染色法
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酸性α 醋酸萘酯酶染色法
一、原理
淋巴细胞内含有许多种酶,如α 醋酸萘酯酶(ANAE)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)
、β 葡萄糖苷酸酶等。不同的淋巴细胞细胞亚群所含酶类及其含量各异,如淋巴母细胞富含ACP,而成熟的T淋巴细胞则显示ANAE活性,因此可利用化学反应作检测。
T淋巴细胞浆内含有的酸性α 醋酸萘酯酶(acid α naphthyl acetate esterase,ANAE) ,在弱酸性条件下,能使底物酸性α 醋酸萘酯水解成醋酸和α 萘酚,后者与六偶氮副品红偶
联,生成不溶性的红色沉淀物,沉积在T淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位,经甲基绿复染,
反应呈现单一或散在的颗粒或斑块,显棕红色。B淋巴细胞则无此种反应。因此ANAE染色法
可作为鉴别T淋巴细胞的一种非特异性方法。此外,单核细胞、中性粒细胞、酸性粒细胞及
血小板等也可呈现酯酶染色阳性反应,应当注意区分。
二、材料和方法
(一) 材料
1 2 5%戊二醛溶液(固定液)在0 1mol/L pH值7 4磷酸盐缓冲液9ml中加入25%戊二醛
溶液1ml,混和,置4℃冰箱保存备用。
2 副品红液将副品红4g加入2mol/L盐酸100ml中,37℃溶解过滤,4℃冰箱保存备用。
3 4%亚硝酸钠溶液取亚硝酸钠400mg,溶于蒸馏水10ml中,临用前配制。
4 六偶氮副品红溶液取新配制的亚硝酸钠溶液3ml,慢慢滴入副品红溶液3ml中,边滴边搅拌,此时有刺激性气体产生。充分混合,1min后备用。
5 α 醋酸萘酯溶液:
α 醋酸萘酯2g
乙二醇单甲醚100ml
也可用丙酮100ml代替乙二醇单甲醚。
6 0 067(1/15)mol/L pH值
7 6磷酸盐缓冲液:
甲液KH 2PO 4 9 08g加蒸馏水至1,000ml
乙液Na 2HPO 4 9 74g加蒸馏水至1,000ml。(如为Na 2HPO 4·12H 2O则称取23
22g)
取甲液13ml,加入乙液87ml,即为0 067mol/L pH值7 6磷酸盐缓冲液。
7 反应液
0 067mol/L pH值7 6磷酸盐缓冲液89ml
六偶氮副品红 6ml(缓慢加入)
α 醋酸萘酯液[KG*2/3]2 5ml(缓慢加入)
8 甲基绿染色液充分混匀,调pH值5 8~6 0,临用前配制。
甲基绿1g
蒸馏水100ml
置37℃溶解,冰箱保存备用。
(二) 方法
1 分离单个核细胞取家兔肝素抗凝血1ml加入Hank s液1ml,加入到含有2ml淋巴细胞分
层液(比重1 077±0 001)的离心管中,以2 000 r/min离心30min。洗涤后,加少量Hank
s液,摇匀。
2 制片取上述细胞悬液1滴,加到洁净玻片上,涂片,自然干燥。
3 固定和染色将制备的细胞涂片用2 5%戊二醛液4℃固定10min,流水冲洗,待干。将
玻片置于反应液内,37℃孵育1h,取出用水冲洗,待干。
4 复染用甲基绿染色液染1min(或瞬时染色),水洗,吹干。油浸镜下观察计数。
三、结果判定
镜检时,首先要判定是否为淋巴细胞。淋巴细胞经ANAE染色后,可区分为两大
类:一类淋巴细胞的胞浆内不见呈色物质,为ANAE阴性细胞;另一类在胞浆中出现棕红色物
质,为ANAE阳性细胞。根据呈色物质的形态和分布又分为块状ANAE阳性淋巴细胞和点状ANAE
阳性淋巴细胞。ANAE阴性淋巴细胞呈黄绿色,胞浆内无明显着色颗粒。
四、注意事项
1 不同质量的试剂,尤其是偶氮染料对反应产物的颜色、鲜艳程度、颗粒粗细和定位清晰
程度等影响很大,应加注意。
2 由于本反应为酶化学反应,反应非常灵敏,各种条件应严格掌握。尤其是试剂的pH值要
求准确,需用精密pH试纸或pH计测定。
3 配制反应液时,各溶液混合,必须边摇边缓慢加入,若滴入过快,可出现沉淀,影响染
色结果。
4 制片过程中,标本要求尽快固定、干燥和冲洗。若时间过长,可影响酯酶活性。
5 涂片插入染色缸时,要注意必须将标本面与反应液接触,切勿将标本面紧贴缸壁,以免
影响染色反应。如片子较多,反应液相对减少,会使阳性率减低。
染色后冲洗不宜过久,防止酶反应产物的红色消减,造成标本观察困难。