体内药物分析

治疗药物监测（TDM）是通过测定血液或其他体液中的药物浓度，在临床药代动力学原理的指导下，使临床给药方案个体化，以提高疗效、避免或减少毒副反应
应用:1）药物有效血药浓度范围狭窄——代表药物地高辛、奎尼丁等2）药物剂量小、毒性大——代表性药物有利多卡因、地高辛等3）药物体内过程个体差异大，具有非线性药代动力学特性——代表性药物有苯妥英钠、茶碱、水杨酸等4）处于某些病理状况（如胃肠道、肝脏、肾脏疾病），应用上述药物治疗时5）合并用药有相互作用而影响疗效或有中毒危险时6）某些药物的毒副作用表现与某些疾病本身的症状相似，不能明确辩别时——代表性药物如地高辛、速尿等7）长期用药的患者，依从性差；或产生耐药性；或诱导和抑制肝药酶的活性；以及原因不明的药效变化时8）常规剂量下出现严重毒性反应时；诊断和处理药物过量中毒；为药物引起的医疗事故提供法律依据时
药物非临床药代动力学研究受试动物
1首选动物：尽可能与药效学和毒理学研究一致。

2尽量在清醒状态下实验，动力学研究最好从同一动物多次采样。

3创新药应选用两种或两种以上的动物，其中一种为啮齿类动物；另一种为非啮齿类动物。

其他类型的药物，可选用一种动物（建议首选非啮齿类动物，如犬或猴等）。

4口服用药不宜选用兔等食草类动物。

5受试动物数：以药时曲线的每个时间点有不少于5个数据为限计算所需动物数。

最好从同一动物多次取样，尽量避免用多只动物合并样本。

多只动物合并样本应相应增加动物数，以减少个体差异对试验结果的影响。

建议受试动物采用雌雄各半，如发现药动学存在明显的性别差异，应增加动物数以便了解药物在雌雄动物体内的药动学的差异情况。

对于单一性别用药，可选择与临床用药一致的性别。

药代动力学研究采样点的确定
1采样点的确定：采样点的确定对药代动力学研究结果有重大影响，若采样点过少或选择不当，得到的血药浓度-时间曲线可能与药物在体内的真实情况产生较大差异，由此计算的药代动力学参数也就失去了意义。

2给药前采血作为空白样品。

给药后的一个完整的血药浓度-时间曲线，应包括药物的吸收相、平衡相和消除相，采样点的设计应兼顾到这三个时相。

一般在吸收分布相至少需要2个采样点，平衡相至少需要3个采样点，消除相至少需要6个点。

整个采样时间至少应持续到3~5个半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/10~1/20。

AUC0-t/AUC0-∞通常应当大于80%。

为保证最佳采样点，建议在正式试验前，选择2~3只动物进行预试验，然后根据预试验的结果，审核并修正原设计的采样点。

测定血药浓度为何常选择血浆和血清，而少用全血？
1.血清与血浆的化学成分与组织液相近，并且内含药物直接与组织液接触并达到平衡，血浆和血清中药物浓度与药物作用部位浓度紧密相关，与药物的临床作用有较好的对应关系。

2.全血含有血细胞，血细胞中的药物暂时作为“贮库”，失去药理作用，且药物在血细胞内与血浆中的浓度比易受各种因素的影响而变化，因此全血不能作为作用部位药物浓度的可靠指标。

3.血细胞膜及红细胞中的血红蛋白会妨碍药物浓度的测定
生物样品预处理的目的
1使药物从缀合物及结合物中释放出来，以测定药物总浓度。

2生物样品介质复杂，干扰多，预处理可纯化、富集被测组分。

3适应和符合测定方法所要求的灵敏度。

4防止分析仪器的污染、劣化，提高测定灵敏度、准确度、精密度和选择性。

去除蛋白的必要性：
1使结合型药物释放以便测定总浓度。

2预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化形成，使提取比较顺利。

3避免与加入的试剂反应，干扰分析。

4防止污染仪器，恶化测定条件。

去除蛋白质的方法
1加入与水相混溶的有机溶剂
原理：破坏分子内、分子间氢键。

常用有机溶剂：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃。

适用于极性较大、水溶性强的样品。

2加入中性盐
原理：可使蛋白质水合的水置换，使蛋白质脱水而沉淀。

常用试剂：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐
3加入强酸
原理：当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。

加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。

常用试剂：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸-钨酸混合液、5％偏磷酸等。

加入量：血样-强酸（1：0.6）
4加入含锌盐及铜盐的沉淀剂
原理：当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。

加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。

常用试剂：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸-钨酸混合液、5％偏磷酸等。

加入量：血样-强酸（1：0.6）
5超滤法
6酶水解法
7加热法
液-液提取法：适用于亲酯性药物
有机溶剂的选择
1 了解被测物与溶剂的性质，根据相似相溶原则选取；
2 溶剂对药物的未电离分子可溶，对其离子形式不溶；
3 沸点低，易挥散、浓集；
4 与水不相混溶（乙醚易引入水分，可用无水NaSO4脱水）；
5 无毒，不易燃烧；
6 不易形成乳化；
7 较高的化学惰性和稳定性；
8 不影响检测。

有机相与水相体积：1：1或2：1
水相的pH值：
1 水相的最佳pH值的选择与药物的pka值有关。

2 对碱性药物，最佳pH值要高于pka值l～2pH单位；对酸性药物，要低于pka值1～2pH单位。

目的：使约90％药物以非电离形式存在。

3 大多在碱性下提取，以除去酸性的内源性物质。

4 对于在碱中不稳定的碱性药物，可在近中性pH处用氯仿和异丙醇提取。

5 对于中性药物，在近中性pH提取。

提取次数：常用一次。

优点：较高的选择性，被测物能与多数内源性物质分离。

缺点：1易发生乳化。

a 水相中加入适量的固体NaCl；b 轻微乳化，可适当离心；c 严重时可快速冷冻，再融化后离心。

2 有机溶剂易挥散、有毒性，不宜自动化。

固相萃取法（SPE）
1原理：将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到“吸附”或“分配”或“离子交换”或其他亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂洗除杂质，再用适当溶剂洗脱药物。

2使用SPE小柱的一般步骤
适当有机溶剂（如甲醇）湿润小柱。

活化填料，以使固定相表面易于和被分析物发生分子间相互作用，除去填料中杂质。

水或适当缓冲液冲洗小柱。

除去甲醇，以便样品与固相表面发生作用。

上样。

使样品经过小柱，被测组分保留，流出液弃去。

水或适当缓冲液冲洗小柱。

除去样品中的内源性杂质和其他杂质。

适当的洗脱溶剂洗脱被分析物。

收集被测组分洗脱液，挥干后或直接测定。

分析方法的建立
1分析方法建立之前
需查阅文献资料——充分了解药物在体内的动力学过程，使所拟定的分析方法避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定。

2初步拟定分析方法后
进行一系列试验工作——选择最佳分析条件
同时验证分析方法的可行性——确认是否适用于实际生物样品
3分析方法的建立和验证过程——是不可截然划分的
——为便于讨论而分别叙述
4分析方法的建立步骤
第一步：检测条件的筛选
取被测组分（药物或代谢产物）、内标物质的标准物质（对照品、标准品或符合标准的原料药）进行试验。

确定最佳检测条件和检测灵敏度（响应值）
色谱条件的确定
第二步：分离条件的筛选。

空白溶剂试验；空白生物基质试验；模拟生物样品试验；实际生物样品的测试。

体外分析方法验证内容
特异性（系指当有内源性物质（其他组分）存在时，方法准确测定待测物质的能力。

1内源性物质的干扰2代谢产物的干扰3配伍用药物的干扰4与参比方法的相关性）
标准曲线与线性范围
精密度（用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度）。

准确度（每次测定结果与多次测定结果平均值的偏离程度。

表示该分析方法的可重复性，即对同一生物样品每次测定结果的一致性）。

定量限（系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度）。

稳定性（包括方法稳定性和样品稳定性）。

提取回收率（将生物样品中分析物提取出来供分析的比例）。

质量控制（将已知量的待测药物加入到空白生物基质中配制的模拟生物样品。

用于整个分析过程的质量控制）。

代谢产物峰的确定：
1 比较实际生物样品、模拟生物样品（或空白样品和对照）
2 由代谢产物的极性，初步判断其出峰位置；
3 在实际样品中峰面积随给药后时间延长先增加后减少；
4 结构已知的特定活性代谢物的测定，通过HPLC-DAD和LC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性，与对照物质比较。

5 对于结构未知的代谢产物的测定，可采用LC-MS或LC-NMR进行结构的初步推测
标准曲线的一般建立方法
将药物对照品（溶液）加入与待测样品相同的空白生物基质中混匀，配成已知药浓的标准样品，然后同待测样品一同按相同方法预处理后测定，将分析得到的响应值，对药浓建立标准曲线。

准确度测定方法：
取空白生物基质（如血浆）数份，照标准曲线项下方法操作，在标准曲线范围内制备至少高(接近上限)、中、低(接近LOQ) 3个浓度的质控(quality control，QC)样品，每一浓度至少5个样品。

与随行的标准曲线同法测定（每个样品分析测定1次）计算。

精密度测定法：照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆)数份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低3个浓度的QC样品，分析测定。

批内RSD：每一浓度5～6个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算三个浓度的RSD。

批间RSD：每一分析批内每一浓度制备一个样品，每个样品测定1次；用随行标准曲线计算三个浓度(每一浓度5～6个分析批数据)的RSD
提取回收率与相对回收率的意义不同
提取回收率：考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失，表示有多少比例的药物自样品中提取供分析。

相对回收率：考察采用标准曲线可否准确计算生物样品中药物浓度，表示方法的准确度。

HPLC流动相使用注意事项
（1）尽量选用纯度高的溶剂，以保证良好的分离效果和较小的基线本底。

试剂的级别：色谱纯；水：重蒸水
（2）滤除不溶性颗粒，以保护泵和色谱柱。

过滤：0.45μm的微孔滤膜（水膜、有机膜）
（3）脱气，以保持基线稳定。

（有气泡，柱压不稳，基线起伏）
方法：超声或过滤
（4）混合均匀（脱气可达到此目的）
（5）pH应符合色谱柱的要求，否则柱床破坏，柱寿命缩短。

HPLC色谱柱的维护
1样品和流动相中要除去大分子杂质和颗粒，尤其是样品中的蛋白质。

以免柱头阻塞，柱子寿命缩短。

2流动相的pH值在适当范围内。

（必须）
3用无机缓冲液做流动相后，应先用水冲洗，再用甲醇冲洗。

（注意：一般C18色谱柱不宜用纯水冲洗，可用含低浓度甲醇水冲洗）
4长期使用后柱效降低，可照说明书依次用不同浓度的溶剂冲洗，使柱子再生。

反向色谱RP－HPLC优点：1.可将含水体液样品直接进样或只经简单去蛋白处理后进样，简化操作。

尤其适用于测定含有极性药物或代谢物的体液样品。

2.体液中内源性杂质多数为极性大的化合物，往往先于药物流出色谱柱，色谱图上这些杂质峰出峰较早，减少了对药物峰的干扰，且有利于及时再进样。

制备高效液相色谱法上样量对峰形的影响：
质量超载：脱尾，保留时间缩短。

体积超载：平头峰，半峰宽等于柱头样品宽度。

质量体积都超载：平头、脱尾
样品溶液不能过浓，否则出现局部超载；溶剂强度不能超过流动相强度，否则破坏色谱柱内平衡。

对内标物的一般要求
①内标物必须是样品中不含有的组分
②内标物保留时间与待测组分相近，但能完全分开R≥1.5
③内标物要有足够的纯度
内标物的选择原则如下：
①内标物与被测药物只相差一个化学元素
②内标物与被测物为同系物
③内标物与被测药物结构相似
④少数情况下也可以选择结构不相似的化合物或药物，但其理化性质也必须与药物相似
免疫分析法基本原理
基于抗体和药物（抗原）结合时具有的专一性、可逆性和最适比例性，利用未标记抗原（被测药物）同标记抗原（标记药物）之间竞争抗体结合原理，建立药物浓度和响应值之间的函数关系，用于生物样品中的药物分析。

抗原抗体反应的基本特点：特异性，可逆性，最适比例性。

三种基本试剂
1标记抗原（标记药物），提供可检测的信号（响应值）
2未标记抗原（药物），制备标准曲线时——指药物标准品或对照品测定时——指被测药物（标准抗原）
3特异抗体，标记抗原（药物）和未标记抗原（药物）竞争结合的蛋白
方法分类
1按是否加入分离剂
均相免疫分析（Homogeneous Immunoassay）
在某些免疫反应中，当抗原－抗体反应达到平衡后，反应液中结合的标记药物与游离的标记药物中，有一种不产生信号或信号消失，因此无需将反应液分作两相，即可在均相溶液中进行测定，故称为均相免疫分析。

非均相免疫分析（Heterogeneous Immunoassay）
在某些免疫反应中，当抗原－抗体反应达到平衡后，只有在反应液中加入分离剂，将游离标记药物和结合标记药物分开之后，才能测出各自部分的标记药物浓度，否则测定的是两者的总浓度。

由于这种信号的测定需将反应液分成液－固两相后，才能分别测定，故称为非均相免疫分析。

2按标记物的种类
放射免疫分析（RIA）
酶免疫分析（EIA）
荧光免疫分析（FIA）
化学发光免疫分析（CLIA）
游离的标记物F和结合的标记物B分离常用方法：
1沉淀法（将抗体视为普通蛋白质，采用蛋白沉淀剂使抗体－药物复合物沉淀，离心，上层为F，沉淀为B，可测定B 或F。

）
2吸附法（利用活性炭的强吸附性和右旋糖酐的分子筛作用，使吸附具有选择性，游离药物可通过分子筛被吸附，结合药物因分子体积大，不能被吸附。

上清液为B，沉淀为F。

）
3固相法（通过物理涂敷或化学结合方法将抗体结合在不溶性固相载体上，待抗原与抗体形成结合物B后附在固相物上，游离抗原F则留在反应液中。

）
4双抗体法（在放射免疫测定系统中，当抗原与抗体(第一抗体)结合反应达到平衡时还不足以生成沉淀而处于“溶解”
状态，此时向以上系统中加入抗-抗体(第二抗体)，则第二抗体与第一抗体特异性地结合，生成复合物沉淀。

离心后，与抗体结合的标记药物（B）处于沉淀中，而游离的标记抗原于上清液中。

）
放射免疫分析RIA方法评价
优点：灵敏度高，特异性强，取样量少，适合于大批量样品测定。

放射免疫试剂盒的应用。

缺点：1、准确度和精密度不及色谱法，制备标准曲线时均采用“双样分析法”，即每个浓度平行测定两次后取平均值。

2、属非均相免疫分析，操作不能完全自动化
3、放射性污染
酶免疫分析法EIA方法评价
优点：①与RIA比，EIA无放射性，可避免对人体的放射性伤害，及对环境的污染。

②酶标记物较稳定，半衰期可超过1年。

③不需要温育，可采用均相免疫方法，不需将F与B分开。

④酶免疫反应产生的信号用普通的可见－紫外分光光度计就可测定，不需昂贵的仪器设备。

缺点：不能直接产生信号，而必须要有其他试剂，如酶底物、辅酶的参与，才能完成酶反应，引起吸收光谱等变化后方可进行测定。

高效毛细管电泳法基本原理
电泳：电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移的现象。

电渗流：毛细管壁内表面带负电，相应缓冲液带正电，形成双电层，高压作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体朝负极方向移动。

电泳淌度：溶质在单位时间间隔内和单位电场下移动的距离。

粒子迁移速度等于电泳和电渗流失量和。

不同电荷离子因迁移速度（电泳淌度）不同而实现分离。

先后顺序：正离子，中性粒子，负离子
液-质联用流动相注意事项
禁用非挥发性盐与酸：硫酸盐、磷酸及其盐。

可用挥发性酸、碱或缓冲剂：如甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水、甲酸铵等。