药物化学实验1

《药物分析》实验大纲

----氯霉素滴眼液的高效液相色谱分析法

一、目的要求

1. 理解内标法和外标法测定组分含量的原理与方法；

2. 掌握高效液相色谱仪的结构及正确使用方法。

二、基本原理

2.1 基础理论来源

《药物分析》（人民卫生出版社，主编刘文英，第6版），第四章药物定量分析与分析方法验证（课本p96-97）。

2.1 实验原理

内标法和外标法是高效液相色谱（HPLC）中常用的两种含量测定方法。

内标物可以消除仪器与操作或制备样本时带来的误差，精密称取样品后，加入一定量的内标物，然后制成适当溶液进样分析。根据样品和内标物的重量及其相应的峰面积，求出某组分的含量。

外标法是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定外标物（标准对照品），把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物（标准对照品）与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。本法俗称外标一点法，色谱定量的原理是峰面积与样品浓度成正比，实验条件要求：需要已知浓度的标准样品，且待测成分与杂质间分离良好。

三、实验方法

（一）实验条件

色谱仪Agilent 1260高效液相色谱仪

色谱柱C18柱(填料：SinoChrom ODS-BP 5 µm，尺寸：4.6 mm×250 mm，大连依利特分析仪器有限公司)

温度室温

流动相甲醇:水(v:v = 80:20)

流速0.8 mL/min

检测波长272 nm

（二）标准贮备液的制备

1. 1㎎/mL 氯霉素标准贮备液的配制

精密称取氯霉素100 mg 至100 mL 容量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度。

2. 1 mg/mL 对硝基苯酚(内标)标准贮备液的配制

精密称取对硝基苯酚约100 mg 置l00 mL 量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度。

(三) 内标法测定氯霉素的含量

1. 相对校正因子的测定

精密吸取对硝基苯酚标准贮备液1.0 mL ，置l0 mL 容量瓶中，精密加入氯霉素标准贮备液1.0 mL ，用甲醇稀释至刻度，摇匀。色谱仪基线平稳后，进样20 μL 得色谱图。读取对硝基苯酚及氯霉素峰面积或峰高，按公式计算相对校正因子（本实验中，采用峰面积法）:

内标内标内标＝A W A W f i i

i （或 内标

内标

内标＝h W h W f i i i ） 式中：W i ――氯霉素重量

W 内标――对硝基苯酚的重量

A i （h i ）――氯霉素的峰面积（峰高）

A 内标（h 内标）――对硝基苯酚的峰面积（峰高）

2. 样品含量测定

精密吸取滴眼液0.4 mL (约相当于氯霉素1 mg ，标示量为2.5 mg/mL)，置10 mL 容量瓶中，并加入对硝基苯酚的贮备液1.0 mL ，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 μL ，得色谱图。按下式计算标示量的百分含量（标示量，简单来说就是主药含量，它的百分含量=实际量/标准量，百分标示量是指的实验测得值与百分之百的偏离程度，即在一个允许范围内稍大或者稍小）：

%100%100%⨯⋅⋅=⨯=内标

样品内标内标样品标示量i i i f W W A A W W 式中：W i ――氯霉素重量

W 内标――对硝基苯酚的重量

W 样品――滴眼液中氯霉素的标示重量

(四) 外标法测定氯霉素的含量（外标一点法）

精密称取氯霉素25.0 mg 置10 mL 容量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度，浓度为2.5 mg/mL 。精密吸取该溶液1.0 mL 置l0 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 μL ，得色谱图，读取峰面积。

精密吸取滴眼液（标示浓度2.5 mg/mL ）1.0 mL 置l0 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 μL ，得色谱图，读取峰面积。按峰面积与样品浓度成正比计算滴眼液中氯霉素含量，即：

对照

样品对照样品C C A A 式中：A 样品：样品的峰面积；

A 对照：对照品的峰面积；

C 样品：样品的浓度（mg/mL ）；

C 对照：对照品的浓度（mg/mL ）；

四、学习提要

1. 内标法和外标法定量的原理、方法及特点。

2. 怎样选择流动相？流动相中水的作用?

3. 内标物应具备哪些条件？

五、实验思考

(1) 由于操作不当，系统中混入了气泡，则对测定有何影响?如何排除这些气泡?

(2) 变换流动相溶剂时，应如何操作?

《药物分析》实验导学

----氯霉素滴眼液的高效液相色谱分析法

一、液相色谱法

液相色谱法就是用液体作为流动相的色谱法。1903年俄国化学家M.C.茨维特首先将液相色谱法用于分离叶绿素。

1、液相色谱法

液相色谱法不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准物作对照定性。当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。2、原理和分类

液相色谱法的分离机理是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别。根据固定相的不同，液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。应用最广的是以硅胶为填料的液固色谱和以微硅胶为基质的键合相色谱。根据固定相的形式，液相色谱法可以分为柱色谱法、纸色谱法及薄层色谱法。按吸附力可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱。近年来，在液相柱色谱系统中加上高压液流系统，使流动相在高压下快速流动，以提高分离效果，因此出现了高效液相色谱法（又称高压液相色谱法）：

①液固吸附色谱

高效液相色谱中的一种，是基于物质吸附作用的不同而实现分离。其固定相是一些具有吸附活性的物质如硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。

②液液分配色谱法

基于被测物质在固定相和流动相之间的相对溶解度的差异，通过溶质在两相之间进行分配以实现分离。根据固定相与流动相的极性不同，分为正相色谱和反相色谱【流动相的极性小于固定液的极性，称为正相色谱法。从色谱发展历史看，最先出现的是正相色谱，当时无所谓正反，只是叫色谱，到后来出现了反相色谱，即流动相的极性大于固定相，为了区分两种类型的色谱，就有了正反之说，现在反而是反相色谱的应用更为广泛】。前者是用硅胶或极性键合相为固定相，非极性溶剂为流动相；后者是硅胶为基质的烷基键合相为固定相，极性溶剂为流动相，适用于非极性或弱极性化合物的分离。