Southern印迹杂交
southern印记杂交
Southern blot印迹杂交原理示意图
详细操作步骤
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一、 待测核酸样品的制备 二、 琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品 三、 电泳凝胶预处理 四、 转膜 五、 探针标记 六、 预杂交 七、 与标记分子杂交 八、 洗膜 九、 放射性自显影检测
电泳凝胶预处理
• DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构。为了
预杂交
• 将固定亍膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，
必须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA 片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前， 必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭， 这就是预杂交的目的。 预杂交的DNA是与哺乳类动物的同源性极低，不 会与DNA探针DNA杂交
•
Southern blot技术优点：
进行有效地实现Southern印迹转移，对电泳凝胶做预处 理十分必要。分子量超过10kb的较大的DNA片段与较 短的小分子量DNA相比，需要更长的转移时间。所以为 了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须 将最长的DNA片段控制在大约2kb以下。DNA的大片段 必须被打成缺口以缩短其长度。因此，通常是将电泳凝 胶浸泡在0.25mol/L 的HCl溶液短暂的脱嘌呤处理之后， 移至于碱性溶液中浸泡，使DNA变性并断裂形成较短的 单链DNA片段，再用中性pH的缓冲液中和凝胶中的缓 冲液。这样，DNA片段经过碱变性作用，亦会使之保持 单链状态而易于同探针分子发生杂交作用。
• 将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到
一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上， 即印迹（blotting）
• 固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的
温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
southern印迹杂交名词解释
southern印迹杂交名词解释Southern印迹杂交是生物学中一个重要的术语，它来源于美国生物学家Edwin Southern所发明的南方杂交技术。
这种技术通常用于DNA分子的检测与分析，在生命科学研究领域具有重要的应用价值。
1.什么是Southern印迹？Southern印迹，又称Southern blot，是一种通过琼脂糖凝胶电泳和酶解技术，将筛选出的DNA样本在膜上进行定向转移，并与特定探针杂交的技术，可以用于检测和分析目标DNA序列。
2.什么是杂交？杂交是指在DNA的两条链之间发生的配对作用。
它是生物学中基本的遗传现象，决定了每个个体的基因型和表型。
3.什么是南方杂交技术？南方杂交技术是一种高效的分子生物学技术，广泛用于分析DNA序列、检测特定基因等方面。
它利用核酸探针与目标DNA的互补配对关系，识别目标DNA序列。
在使用Southern blot技术时，DNA样品首先通过电泳将不同长度的DNA分离出来，然后将其转移到琼脂膜上。
接着，利用探针特异性杂交，标记目标DNA的特定区段。
最后，利用探针上的标记（如酶或荧光）将目标DNA区段从杂交物质中分离出来并检测，以获取样品的DNA序列和长度信息。
4. Southern印迹与Northern印迹、Western印迹有什么不同？Southern印迹用于检测已知DNA序列，与之对应的Northern印迹用于检测RNA序列，而Western印迹则是用来检测蛋白质。
三种印迹技术都是利用探针与目标分子的互补配对关系，识别目标分子，并将其从杂交物质中分离出来以便检测。
5. Southern印迹技术的应用Southern印迹技术具有广泛的应用价值。
它可以用于检测和鉴定病菌、遗传疾病、肿瘤等疾病相关基因，进行生物工程和基因工程的基因克隆和筛选，进行DNA序列测定和鉴定等。
不仅如此，该技术也可以应用于无机化学、有机化学、分析化学等领域。
总之，Southern印迹技术的出现和发展，促进了生命科学、医学和生物工程等领域的发展，也推动了DNA以及其他分子的检测和分析研究。
Southern杂交方法
分子植物病理学实验--Southern杂交（同位素标记，防止污染！注意物品的放置与处置，检测！）核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。
其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则退火形成双链，杂交的双方是待测核酸序列及探针。
膜上印迹杂交是指待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。
其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。
再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。
最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。
由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小。
Southern印迹是指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。
（目的：分析遗传位点、拷贝数；多态性；来源；文库分析；基因敲除；亚克隆；基因分离与检测等）一、基因组DNA的提取（选择方法；提取要完全，CTAB\SDS:去多糖的，冷却后再加好；去上清液要适度）二、基因组DNA的酶切（注意：酶种类、浓度、酶切时间（少于16h）等因素）三、电泳（胶要倒平（平衡！！），厚度一致；胶越浓，孔越小）琼脂糖浓度0.8 %，4℃下低电压缓慢电泳，1V/cm。
四、转膜（为毛细管法，也可电转移）↓首先要在电泳盒中取出凝胶，修胶，切除无用的凝胶部分，将凝胶的左下角切去，以便于定位。
然后将凝胶置于一搪瓷盆中。
（注意：进样孔要切除，因其薄，易透液。
留14cm；切左下角以示标记；用胶片托转）↓将凝胶浸泡于0.25N HCl中10min使其脱嘌呤.↓将凝胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量的0.4N NaOH中变性20min。
southern杂交
Southern流程示意 Southern流程示意
基因组DNA 基因组DNA
限制性酶切
DNA限制片段 DNA限制片段
琼脂糖凝胶电泳
转 膜
转移缓冲液
பைடு நூலகம்与标记探针杂交 检测
盖子 两层长滤纸 三层湿滤纸 凝胶 n+ 尼龙膜 三层湿滤纸 十层干滤纸 10cm吸水纸 10cm吸水纸
转膜
即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上。而此过 程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。DNA是沿与凝胶 平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此，凝胶中的DNA片段虽 然在碱变性过程已经变性成单链并已断裂，转移后各个DNA片段 在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，故而称为印 迹（blotting）。用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素 膜（NC膜）、尼龙（Nylon）膜、化学活化膜和滤纸等，转膜时 可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。其中常用的是 NC膜和Nylon膜。各种膜的性能和使用情况比较见各种尼龙膜性 能及使用情况比较表。
与标记分子杂交
• （一）原理 • 转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h，即可加入标记的探针 转印后的滤膜在预杂交液中温育 ， DNA（探针 预先经加热变性成为单链DAN分子），即可进行杂 分子）， （探针DNA预先经加热变性成为单链 预先经加热变性成为单链 分子），即可进行杂 交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜， 交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜， 然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高， 然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高，杂交的 严格程度越高，也就是说， 严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源 性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。 性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。 • （二） 步骤 • 1.将标记的 将标记的DNA探针置沸水浴 探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min， ，迅速置冰上冷却 ， 将标记的 探针置沸水浴 变性。 使DNA变性。 变性 • 2.从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋，剪开一角，将变 从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋， 从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋 剪开一角， 性的DNA探针加到预杂交液中。 探针加到预杂交液中。 性的 探针加到预杂交液中 • 3.尽可能除取袋中的空气，封住袋口，滞留在袋中的气泡要尽可 尽可能除取袋中的空气， 尽可能除取袋中的空气 封住袋口， 能地少，为避免同位素污染水浴， 能地少，为避免同位素污染水浴，将封好的杂交袋再封入另一个未污 染的塑料袋内。 染的塑料袋内。 • 4.置42℃水浴温育过夜（至少 置 ℃水浴温育过夜（至少18h）。 ）。
Southern 印迹杂交实验报告
Southern 印迹杂交实验报告姓名：陆叶学号：14211020062 专业：公共卫生实验时间：12.18；12.25 带教老师：潘銮凤【实验目的】学习核酸杂交的基本过程和操作【实验原理】将待检测的DNA分子用或不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
【实验步骤】1、基因组DNA的限制性内切酶酶切取1个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。
老师给的HL60基因组DNA 10μg（7.6μL）；10×Buffer E（10.4μL）；EcoR I（10 u/μL）（2μL）。
总体积20μL。
37℃保温1.5小时。
2、1％琼脂糖电泳先制备凝胶，称取1.2 g Agarose放入三角烧瓶中，加入60 mL TAE溶液，微波炉中加热令其完全溶解，稍作冷却后加入GelRed核酸染液6μL（稀释10,000倍）。
浇板，水平放置，待凝。
胶凝后按照以下顺序加样。
两组共用一块凝胶，共7个样。
①基因组DNA10 20μl （自己的）②基因组DNA10 μg（老师的）③酶切样品④阳性对照（c-myc 4.7 kb线性片段，30pg/μl, 10μl)⑤酶切样品⑥基因组DNA10 μg （老师的）⑦基因组DNA10 20μl （自己的）插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小时左右，直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。
Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介
Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介姜永均 (江苏省如东高级中学 226400)摘 要 Southern印迹杂交(Southern b l ot)是分子生物学领域中最常用的技术方法之一,该技术是1975年英国爱丁堡大学的E. M.Sou t h ern首创的,Sou t h ern印迹杂交故因此而得名。
后来相继出现了三个原理、过程相似,但是操作对象不同的印迹方法,缘于学界前辈的幽默分别将其称为N ort h ern b l ot、W estern blot和Eastern b l ot,这些技术的命名与发明人姓氏并没有关系。
本文简要介绍了Sou t hern印迹杂交及其相关生物技术。
关键词 Sou t hern印迹杂交 Northern印迹杂交 W estern印迹杂交 Eastern印迹杂交在近年的一些省、市中学生生物奥赛试卷中常涉及到Southern印迹、N outhern印迹、W este m印迹等分子生物学技术。
本文将Sout hern印迹杂交及其相关生物技术作一个简单介绍。
Souther n印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法,是研究DNA图谱的基本技术,在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。
Souther n印迹杂交技术1975年由英国人埃德温 迈勒 萨瑟恩(Ed w i n M ellor Southern)创建。
1977年詹姆斯 艾尔文(Ja mes A l w ine)等把此方法应用到RNA的研究方面,称作Northern印迹法。
1979年乔治 斯塔克(G eor ge Stark)等则把该方法扩展应用到单向电泳后的蛋白质分子的分析方面,被称作W estern印迹法。
1982年Re i nhart报道双向电泳后蛋白质分子的印迹分析,称之为Eastern印迹法。
目前,有人把Sou hern、Nort hern、W esther印迹法分别称作DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法。
分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术 ppt
分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术摘要：上世纪70年代美籍华裔科学家简悦威采用Southern印迹杂交技术成功诊断了α地中海贫血症和镰状细胞贫血症，开创了临床分子生物学检验的先河，他是怎样做到的呢？知识点：分子杂交、核酸分子杂交、探针Southern印迹杂交、琼脂糖凝胶电泳技术、印迹技术临床分子生物学检验技术的发展第一阶段：分子杂交第二阶段：PCR第三阶段：生物芯片第四阶段：DNA测序美籍华裔科学家简悦威应用DNA分子杂交技术诊断α地中海贫血(1976)、镰状细胞贫血(1978)分子杂交(molecular hybridization) 两条单链核酸、抗原与抗体、受体与配体等经相互作用重新组成新的杂交分子图片源于网络非原创核酸分子杂交两条序列互补的单链核酸之间(DNA 与DNA ，DNA与RNA或RNA与RNA)借助氢键相连形成杂合双链碱基互补配对A=T,A=U,C≡G杂合双链图片源于网络非原创核酸分子杂交：待测核酸与探针图片源于网络非原创核酸探针 (nucleic acid probe)能与待测靶核酸特异互补杂交的已知被标记的核酸分子核酸探针的标记1.放射性核素标记：32P、3H、35S等2.非放射性标记：生物素、地高辛、荧光素等分子杂交(molecular hybridization)反应介质液相杂交固相杂交原位杂交印迹杂交Southern印迹杂交(E.M.Southern,1975) ——镰状细胞贫血症的分子诊断(1978)琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术视频源于网络非原创琼脂糖凝胶电泳技术——分离、纯化、鉴定核酸 碱性缓冲液 琼脂糖凝胶 负极 正极核酸加样孔 电极琼脂糖凝胶电泳技术可将分子量和构象不同的核酸分子进行分离小分子量核酸电泳结束后不同分子量的核酸的迁移位置琼脂糖凝胶电泳技术图谱DNA Marker 核酸样品琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术印迹技术 (Blotting）将核酸分子通过一定方式转移并固定到固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上印迹技术膜核酸凝胶琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术视频源于网络非原创应用Southern印迹检测红色特异DNA片段1. 从样品中提取DNA并通过限制性核酸内切酶消化样品DNA2.消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离3. 凝胶中DNA经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交6. 通过洗涤除去未杂交的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段Southern 印迹技术1. 通过限制性核酸内切酶消化样品DNA，2. 消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离，3. 凝胶上被分离好的DNA片段经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定，5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交，6. 杂交后洗脱未特异结合的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA 片段杂交检测杂交信号预杂交制备携带标记的核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针图片源于网络非原创应用Southern印迹杂交技术诊断镰状细胞贫血？分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术。
southern印记杂交
实验步骤
基因组DNA经酶切成小片段（EcoR I或 Hind III） 电泳分开各片段（1％琼脂糖凝胶电泳） 变性（双链经碱变性解开成两条单链） 转膜及固定（DNA经毛细管作用转移到尼龙膜上， 紫外交联固定） 预杂交（减少标记探针的非特异性结合， 小分子鲑精DNA为竞争性封闭剂） 杂交（靶DNA单链与DIG标记的c-myc探针之间以 碱基互补的原则进行杂交） 洗膜（洗去未与靶DNA结合的探针） 检测（杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色）
体积越小,杂交动力学越高;
DNA/DNA杂交适宜的复性温度为比Tm低20～25℃;
温度↓非特异性↑; 温度↑敏感性↓
影响杂交的因素
4）杂交液的离子强度
低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率增加(Na+ 的作用) 高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序列不完 全同源的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液中较高的盐 浓度;
Southern杂交技术原理
Southern杂交技术是由Edward M. Southern在 1975年首先发明的用于检测DNA的一种核酸杂交 技术，并因此而得名 根据毛细管作用的原理，将在电泳凝胶中分离的 DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过 与标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用，检测 这些被转移的DNA片段。
1d
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实验步骤
二. 1％琼脂糖电泳
两组共用一块凝胶，共7个样 1.基因组DNA10 mg 2.酶切样品（1） 3.酶切样品（2） 4.阳性对照（pSV-c-myc重组质粒经BamH I 酶切后的8.5 kb线性片段，10pg/ml, 10ml) 5.酶切样品（1） 6.酶切样品（2） 7.基因组DNA10 mg
southern印迹技术名词解释(二)
southern印迹技术名词解释(二)南方印迹技术名词解释1. 南方印迹技术 (Southern Blotting)南方印迹技术是一种分子生物学技术，用于检测DNA分子在细胞或组织中的存在和定位。
它的原理是通过电泳将DNA分子分离开，然后利用DNA探针与目标DNA序列特异性结合，最后通过探针标记物的检测来确定目标DNA的存在及其大小。
2. DNA探针 (DNA Probe)DNA探针是一种用于检测目标DNA序列的标记物。
它通常是一段特异性的单链DNA或RNA片段，可以与目标DNA序列互补配对。
DNA探针可以通过标记化学物质（如放射性同位素、荧光染料等）标记，以便于检测和定位目标DNA序列。
举例： DNA探针可以用于检测某个特定基因在某个组织中的表达水平。
例如，通过标记了荧光染料的DNA探针，科学家可以观察到某个基因在组织切片中的表达情况，从而了解基因在该组织中的功能和调控机制。
3. DNA电泳 (DNA Electrophoresis)DNA电泳是一种通过电场力将DNA分子在凝胶或琼脂糖基质中进行分离和定性的技术。
它利用DNA分子在电场中的迁移速度与分子大小、形状和电荷有关的特性，实现DNA分子的分离和鉴定。
举例： DNA电泳可以用于分离和区分不同长度的DNA片段。
例如，在南方印迹技术中，经过电泳分离后的DNA片段可以被转移到膜上，并通过后续的探针结合和检测来确定目标DNA片段的存在与否。
4. DNA杂交 (DNA Hybridization)DNA杂交是指通过两个互补的DNA序列在一定条件下形成双链结构的过程。
在南方印迹技术中，DNA杂交是指DNA探针与目标DNA序列的特异性结合，以便于后续的检测和分析。
举例： DNA杂交可以用于检测基因突变或多态性。
例如，通过将荧光标记的DNA探针与目标DNA杂交，可以发现特定的基因突变或多态性，从而了解这些变异对个体的遗传特征或疾病易感性的影响。
5. 南方印迹仪 (Southern Blot Apparatus)南方印迹仪是用于实施南方印迹技术的专门仪器设备。
分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术 ppt
分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术摘要：上世纪70年代美籍华裔科学家简悦威采用Southern印迹杂交技术成功诊断了α地中海贫血症和镰状细胞贫血症，开创了临床分子生物学检验的先河，他是怎样做到的呢？知识点：分子杂交、核酸分子杂交、探针Southern印迹杂交、琼脂糖凝胶电泳技术、印迹技术临床分子生物学检验技术的发展第一阶段：分子杂交第二阶段：PCR第三阶段：生物芯片第四阶段：DNA测序美籍华裔科学家简悦威应用DNA分子杂交技术诊断α地中海贫血(1976)、镰状细胞贫血(1978)分子杂交(molecular hybridization) 两条单链核酸、抗原与抗体、受体与配体等经相互作用重新组成新的杂交分子图片源于网络非原创核酸分子杂交两条序列互补的单链核酸之间(DNA 与DNA ，DNA与RNA或RNA与RNA)借助氢键相连形成杂合双链碱基互补配对A=T,A=U,C≡G杂合双链图片源于网络非原创核酸分子杂交：待测核酸与探针图片源于网络非原创核酸探针 (nucleic acid probe)能与待测靶核酸特异互补杂交的已知被标记的核酸分子核酸探针的标记1.放射性核素标记：32P、3H、35S等2.非放射性标记：生物素、地高辛、荧光素等分子杂交(molecular hybridization)反应介质液相杂交固相杂交原位杂交印迹杂交Southern印迹杂交(E.M.Southern,1975) ——镰状细胞贫血症的分子诊断(1978)琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术视频源于网络非原创琼脂糖凝胶电泳技术——分离、纯化、鉴定核酸 碱性缓冲液 琼脂糖凝胶 负极 正极核酸加样孔 电极琼脂糖凝胶电泳技术可将分子量和构象不同的核酸分子进行分离小分子量核酸电泳结束后不同分子量的核酸的迁移位置琼脂糖凝胶电泳技术图谱DNA Marker 核酸样品琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术印迹技术 (Blotting）将核酸分子通过一定方式转移并固定到固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上印迹技术膜核酸凝胶琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术视频源于网络非原创应用Southern印迹检测红色特异DNA片段1. 从样品中提取DNA并通过限制性核酸内切酶消化样品DNA2.消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离3. 凝胶中DNA经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交6. 通过洗涤除去未杂交的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段Southern 印迹技术1. 通过限制性核酸内切酶消化样品DNA，2. 消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离，3. 凝胶上被分离好的DNA片段经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定，5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交，6. 杂交后洗脱未特异结合的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA 片段杂交检测杂交信号预杂交制备携带标记的核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针图片源于网络非原创应用Southern印迹杂交技术诊断镰状细胞贫血？分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术。
southern印迹杂交中的操作流程原理
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southern印迹杂交实验报告
southern印迹杂交实验报告Southern 印迹杂交实验报告一、实验目的Southern 印迹杂交（Southern blotting）是进行基因组 DNA 特定序列定位的通用方法。
本次实验的主要目的是通过 Southern 印迹杂交技术检测特定基因在基因组中的存在和拷贝数，掌握该技术的基本原理和操作流程。
二、实验原理Southern 印迹杂交是将电泳分离的 DNA 片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后与标记的探针进行杂交，通过检测杂交信号来确定与探针互补的 DNA 片段的位置和大小。
其基本原理包括：DNA 的变性与复性、分子杂交以及检测技术。
DNA 变性是指在加热或碱性条件下，双链 DNA 解链成为单链。
电泳分离后的 DNA 片段在转移前需要进行变性处理，使其成为单链，以便更好地与探针结合。
分子杂交是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。
标记的探针与膜上的 DNA 单链进行杂交，形成杂交体。
检测技术通常使用放射性同位素或非放射性标记物（如地高辛、荧光素等）标记探针，通过放射自显影、化学发光或荧光检测等方法显示杂交信号。
三、实验材料与仪器1、材料基因组 DNA 样品限制性内切酶琼脂糖电泳缓冲液硝酸纤维素膜或尼龙膜标记的探针杂交液2、仪器电泳仪水平电泳槽紫外透射仪真空转移装置或毛细管转移装置杂交炉放射性检测仪或化学发光检测仪四、实验步骤1、 DNA 提取与定量使用适当的方法从细胞或组织中提取基因组 DNA，并通过分光光度计或琼脂糖凝胶电泳对其进行定量和质量检测。
2、限制性内切酶消化将一定量的基因组 DNA 与适量的限制性内切酶在适宜的反应条件下进行消化，使 DNA 片段化。
3、琼脂糖凝胶电泳制备琼脂糖凝胶，将消化后的 DNA 样品进行电泳分离。
电泳结束后，在紫外灯下观察并拍照记录电泳结果。
4、 DNA 变性与转移将凝胶浸泡在变性液中使 DNA 变性。
采用真空转移或毛细管转移等方法将 DNA 从凝胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。
southern印迹杂交
southern印迹杂交Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。
一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量[1][2]。
[编辑本段]基本方法及主要步骤Southern印迹杂交的基本方法包括四部分，以下以植物southern印迹杂交为例。
（1）植物基因组DNA提取；（2）DNA的限制性内切酶酶解、电泳和Southern转移；（3）探针的标记和纯化；（4）杂交、洗膜、检测以及去除膜上探针。
主要操作步骤：1．琼脂糖电泳（1）取一定量的待测DNA样品，用适当的限制性内切酶酶切。
DNA的量根据样品的种类及实验目的的不同而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取0.1-0.5μg即可；而对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因序列，则需要10～20μg；当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时，则需要30～50μg。
（2）酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳。
（3）电泳结束后，EB染色，长波紫外线下观察电泳结果及照相。
2．印迹转移（1）切胶并作标记（左下角切除），以便于定位，然后将凝胶置于一容器中。
Southern印迹杂交转膜示意图（2）将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温下放置1h 使之变性，不间断地轻轻摇动。
（3）将凝胶用去离子水漂洗1次，然后浸泡于适量的中和液中30 min，不间断地轻轻摇动。
更换中和液，继续浸泡15 min。
（4）将滤纸，硝酸纤维素膜NC膜(以下简称NC膜）剪成与胶同样大小，NC 膜浸入转移buffer中平衡30 min。
（5）按右图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。
（6）虹吸转移12-16h。
3．固定DNA（1）取出转移后的NC膜，用滤纸吸干NC膜，NC膜光面朝上平铺于变性液中变性5min。
Southern印迹杂交实验原理和方法-3
Southern印迹杂交实验原理和方法-3真空转移法的最大优点是迅速，可在转膜的同时进行DNA变性与中和整个过程约需3 0～60分钟。
但在操作中应注意两个问题，一是真空压力不能太大，若压力过大，凝胶被压缩，转移效率会降低；二是真空转移液要密封严，防止漏气影响压力的产生。
下表列出了不同的印迹方法。
表10－2 不同印迹方法的比较表五、探针标记用于Southern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。
探针可以用放射性物质标记或用地高辛标记，放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。
人工合成的短寡核苷酸可以用T4 多聚核苷酸激酶进行末端标记。
探针标记的方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，详细方法参见本书相关章节。
这里介绍放射标记。
以下为 Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：（一）取25～50mg模板DNA于0.5ml离心管中，100℃水浴5min，立即置冰浴。
（二）在另一个0.5ml离心管中加入：Labeling 5×Buffer (含随机引物) 10μldNTPmix(含dCTP.dGTP.dTTP各0.5mmol/L) 2μlBSA(小牛血清蛋白) 2μl[α-32ρ] dATP 3μlKlenow 酶 5U（三）将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl混匀。
室温或37℃ 1h.（四）加50μl终止缓冲液终止反应标记后的探针可直接使用或过柱纯化后使用。
由于α-32ρ的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。
探针的比活性最好大于 1091计数/分/μl。
六、预杂交（prehybridizafion）将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。
因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。
预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。
Southern杂交技术
一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交的分类：
②固相杂交：将参加反应的一条核酸链先 固定在固体支持物上，另一条游离在溶 液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、 尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。 固相杂交时，未杂交的游离片段可容易 地漂洗除去，膜上的杂交物容易检测和 能防止靶DNA自我复性等优点，故该法最 为常用。
8、杂交结果的检测
② 非放射性核素探针的检测
显色反应：通过连接在抗体或抗生物素蛋白上的显色物质（如酶、荧光 素等）进行杂交信号的检测。常用的检测物质与方法有以下几类：
– 酶法检测：这是最常用的检测方法。通过酶促反应使其底物形成有 色反应产物。最常用的酶是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。
– 荧光检测法：荧光检测法主要用于非放射性探针的原位杂交检测。 – 化学发光法：化学发光是指在化学反应过程中伴随的发光反应。 – 电子密度标记：利用重金属的高电子密度，在电子显微镜下进行检
二、Southern杂交的基本原理
• 利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切 、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定 量分析、基因突变分析及限制性片断长度多 态性分析（RFLP）等。
三、Southern 杂交的主要步骤
1、待测DNA样品的制备、酶切 2、待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
⑥探针标记 –随机引物法 –缺口平移法 (DNaseI and DNA聚合酶I) –末端标记法 • 碱性磷酸酶-T4多核苷酸激酶 [γ-32p]-ATP标记 DNA/RNA-5′ • 末端转移酶（poly(N*)n） • T4DNA聚合酶/Klenow片断 （粘末端补平）
同源性比较，与非靶区域的同源性不应超过70%或有连 续8个或更多的碱基同源。
southern印迹技术名词解释(一)
southern印迹技术名词解释(一)Southern印迹技术名词解释1. Southern印迹技术Southern印迹技术是一种用于检测DNA序列的实验室技术。
它是以美国分子生物学家Edwin Southern的名字命名的，于1975年首次提出并应用于DNA研究。
2. 南方-杂交南方-杂交(或Southern杂交)南方-杂交，也被称为Southern杂交，是指通过DNA探针与目标DNA序列的互相杂交来检测或定位特定DNA片段的技术。
它通常用于检测基因的特定序列或在DNA样品中的拷贝数。
DNA探针DNA探针是一种标记有放射性同位素、荧光染料或其他检测标记的DNA片段。
它可以与目标DNA序列互相配对，用于检测特定基因或DNA序列的存在和定位。
南方-印迹南方-印迹是基于南方-杂交技术来检测目标DNA序列的实验过程。
它通过将DNA样品分离、杂交、重组和显影等步骤，最终生成可见的DNA条带用于分析。
3. 南方-印迹的应用基因诊断南方-印迹技术可以用于基因诊断，即检测某个个体是否携带特定基因或遗传突变。
例如，通过南方-印迹可以检测常见遗传病的致病基因，为临床治疗提供依据。
进化研究南方-印迹技术在进化研究中也有广泛应用。
通过比较不同物种或个体的DNA序列差异，可以揭示物种间的亲缘关系和进化历程。
犯罪科学南方-印迹技术在犯罪科学中起到重要的作用。
通过对犯罪现场的DNA样本与嫌疑人的DNA进行南方-印迹比对，可以确定犯罪嫌疑人的身份。
4. 总结Southern印迹技术是一种重要的实验室技术，通过南方-杂交和DNA探针的应用，可以检测特定基因或DNA序列的存在和定位。
它在基因诊断、进化研究和犯罪科学等领域有着广泛的应用。
Southern印迹杂交作业指导书
Southern印迹杂交作业指导书实验目的学习和掌握Southern印迹杂交技术，检测重组DNA分子中是否含有目的基因片段。
实验原理具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异性的。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上，即印迹(blotting)；二是固定于膜上的核酸同同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
这种技术是E．M．Southern l975年首创的，因此称Southern印迹杂交。
Southern印迹的印迹方法有毛细管法、电转法、真空转移法，滤膜有尼龙膜、化学活化膜(如ABM、APT纤维素膜)等。
这里主要介绍目前常用的电转法。
电转法是利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，是近年来发展起来的一种简单、迅速、高效的DNA转移法。
一般只需2～3h，对于用毛细管法不理想的大片段DNA的转移较为适宜。
常用的电转仪有铂金丝电极和石墨电极。
实验内容材料和试剂印迹试剂l．待测样品，适当的限制性内切酶、琼脂糖。
2．变性液 1.5mol／L NaCl，0.5mol／LNaOH，高压灭菌。
3．中和液1mol／L Tris·HC1(pH8.0)，1.5mol／L NaCl，高压灭菌。
4．电泳液和转移液1×TBE或TAE。
5．尼龙膜、铂金丝电极电转仪。
杂交试剂1．预杂交液5×Denhardt试液，50mmol／L磷酸缓冲液(pH7.0)，0．2％SDS，500μg／m1变性的鲑精DNA片断，50％甲酰胺(也可不用)。
2．20×SSC，3mol／L NaCl 0.3mol／L柠檬酸钠。
3．2×SSC，0.1％SDS 溶液。
4．0.1×SSC，0.1％SDS溶液。
5．0.1×SSC溶液。
基因组DNA Southern杂交操作步骤
基因组DNA Southern杂交操作步骤1）基因组DNA Southern印迹的制备预备1．用适当的限制性内切酶消化基因组DNA样品（10μg）。
2．进行琼脂糖凝胶电泳。
一般用0.7～1.0％的琼脂糖凝胶分离基因组DNA，它在1～15kb的范围内有较好的分辨率，可选用TBE或TAE缓冲液。
琼脂糖凝胶电泳需在1V/cm的电压下进行，如果要分离片段大小相似的DNA带，应用较大的凝胶（20×25cm）。
常用的标准品是由Hind Ⅲ消化的λDNA、Hae Ⅲ消化的ΦX174 DNA和100或1000bp的梯形图谱。
电泳完毕，将凝胶放在紫外透射仪上，并在凝胶旁放一尺子进行拍照。
当把凝胶从盘内移动紫外透射仪时，小心不要将凝胶滑落或弄破。
Southern印迹的制备1．将凝胶转移至塑料盒内。
2．加入至少4倍凝胶体积的0.25mol/L HCl使DNA脱嘌呤，置室温摇床温育15min。
这时凝胶上样缓冲液中的溴酚蓝应变黄色，如果15min后仍呈蓝色，应再温育5min。
3．小心地塑料盒内HCl弃去，用蒸馏水漂洗凝胶一次。
4．加入至少4倍体积的变性缓冲液，置室温摇床温育20min。
5．用新鲜缓冲液重复步骤4，小心弃去变性缓冲液，用蒸馏水稍加漂洗。
6．加入至少4倍体积的中和反应缓冲液，置室温摇床温育15min。
7．用新鲜缓冲液重复步骤6。
8．当处理凝胶时，裁一张略大于凝胶的滤膜（硝酸纤维膜或尼龙膜），预先用蒸馏水将滤膜浸湿后用20×SSC浸泡至少15min。
9．安装转移装置。
在盘中加入印迹缓冲液（20×SSC），在缓冲液面作一平台，比如可倒置一凝胶盘，上面盖三张经20×SSC饱和过的滤纸（Whatman 3MM），平台两侧的滤纸应浸泡在缓冲液中，用10ml的玻璃吸管在其表面小心滚动以赶出所有气泡，并将滤纸推平。
10.倒数毫升20×SSC于滤纸表面，将凝胶面向下倒扣在滤纸上，小心赶出凝胶与滤纸间的气泡，凝胶四周用胶布或塑料薄膜包裹以防缓冲液从凝胶周围直接流至纸中（虹吸短路）。
Southern杂交
Southern 杂交（一）目的通过分子杂交，检测重组DNA分子中插入的外源基因是否确是原供体中的某一基因片段。
（二）原理Southern 印迹杂交是指将经凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相支持物上（通常是尼龙膜或硝酸纤维膜），再通过特异性的探针杂交来检测被转移的DNA的片段的一种技术。
Southern 杂交的实验流程如下：基因组DNA样品的限制性酶切-> 酶切样品的琼脂糖凝胶电泳-> DNA的变性、转膜与固定-> 杂交与杂交后清洗-> 杂交结果的检测（三）材料1.基因组DNA样品的限制性酶切：1）样品：GFP蛋白基因2）试剂：限制性内切酶；10x酶切缓冲液；0.5mol/L EDTA；Tris-饱和酚；氯仿/乙醇=24：1（体积比）；预冷无水乙醇和70%乙醇；TE缓冲液3）仪器及器材：恒温水浴锅；电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪2.酶切样品的琼脂糖凝胶电泳：1）样品：上一个实验的酶切产物2）试剂：琼脂糖；1xTAE缓冲液；6xDNA加样缓冲液；EB溶液；DNA分子量标准（DNA Marker）3）仪器及器材：电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪；凝胶成像分析系统；微量移液器3.DNA的变性、转膜与固定：1）样品：电泳后的琼脂糖凝胶2）试剂：水解液（0.25mol/L HCL）；变性液（1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L NaOH, 0.2mol/L HCL）；中和液（1mol/L Tris-HCL pH=7.4, 1.5mol/L NaCl）；硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜；碱性转移缓冲液（0.4mol/L NaOH, 1mol/L NaCl）；20xSSC（3mol/L NaCl, 0.3mol/L 柠檬酸三钠pH=7.0）；20xSSPE（3.6mol/L NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4, 0.02mol/L EDTA pH=7.7）；50xDenhardt 试剂（5g聚蔗糖Ficoll 400, 5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白，加入无菌蒸馏水至500ml）3）仪器及器材：印迹转膜装置（托盘、支持物、Whatman 3MM滤纸、纸巾、玻璃板、重物等），紫外交联仪4.杂交与杂交后清洗：1）样品：固定了DNA酶切样品的硝酸纤维膜2）试剂：预杂交液（6xSSC, 5xDenhardt试剂, 0.5% m/V SDS, 1μg/ml polyA, 100μg/ml 鲑鱼精DNA, 50% V/V 甲酰胺）3）仪器及器材：杂交管（瓶），杂交炉5.杂交结果的检测：1）样品：杂交后已清洗的NC膜2）试剂：显影液，定影液3）仪器及器材：X线胶片，X线胶片盒（带增感屏），保鲜膜（四）步骤基因组DNA样品的限制性酶切：1）酶切：在1.5ml离心管中依次加入ddH2O Xμl；1μg/μl DNA 20μg；10x酶切缓冲液4.0μl；10U/μl限制性内切酶5.0μl，总体积500μl。
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Southern印迹杂交实验原理核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。
其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。
但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。
有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）;二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。
早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。
近年来印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。
利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。
实验方法本节以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。
一、待测核酸样品的制备（一）制备待测DNA基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。
1. 采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2. 用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3. 用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。
（二）DNA限制酶消化基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。
一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。
切割DNA的条件可根据不同目的设定，有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。
消化DNA后，加入EDTA，65℃加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。
二、琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品（一）基本原理Southern印迹杂交是先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片断长短进行分离，然后进行杂交。
这样可确定杂交靶分子的大小。
因此，制备DNA样品后需要进行电泳分离。
在恒定电压下，将DNA样品放在0.8～1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨70－80000bp的DNA片段，故可对DNA片段进行分离。
但需要用不同的胶浓度来分辨这个范围内的不同的DNA片段。
原则是分辨大片断的DNA需要用浓度较低的胶，分辨小片段DNA则需要浓度较高的胶。
琼脂糖凝胶是由琼脂糖形成的网状物质，具有分子筛作用。
在相应的电泳缓冲液中，DNA在电场的作用下由负极向正极泳动，分子越大，泳动速度越慢；反之，分子小则泳动速度快，而大小相同的分子则泳动速度相同。
因此在恒定的电场下，经过一段时间电泳后，DNA按分子大小在凝胶中形成许多条带，大小相同的分子处于同一条带。
另外为了便于测定待测DNA分子量的大小，往往同时在样品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA样品即标准分子量DNA （DNA marker）进行电泳。
DNA marker可以用放射性核素进行末端标记，通过这种方式，杂交后的标准分子量DNA也能显影出条带。
在制备凝胶和电泳过程中需要注意的几个问题是：第一、尽可能在使用之前配制新鲜凝胶；第二、如果使用的胶比较薄，铺胶后1h内使用；第三、胶中不要含有EB，否则会引起非特异性背景；第四、电泳结束后用1μg/ml的EB染色，然后用水脱色（如果胶里含的是RNA，则使用无RNA酶的水），以保证核酸的完整性。
（二）基本步骤1. 制备琼脂糖凝胶，尽可能薄。
DNA样品与上样缓冲液混匀，上样。
推荐使用的靶基因的上样量见下表：表4－1 不同条件下上样本的使用指针比较表一般而言，对地戈辛杂交系统，所需DNA样品的浓度较低，每道加2.5-5μg人类基因组DNA；如果基因组比人类DNA 更复杂（如植物DNA）则上样量可达10μg；每道上质粒DNA<1ng。
2. 分子质量标志物（DIG标记）上样。
3. 电泳，使DNA条带很好的分离。
4. 评价靶DNA的质量。
在电泳结束后，0.25-0.50μg/mlEB染色15-30min，紫外灯下观察凝胶。
三、电泳凝胶预处理（一）原理DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构。
为了进行有效地实现Southern印迹转移，对电泳凝胶做预处理十分必要。
分子量超过10kb的较大的DNA片段与较短的小分子量DNA相比，需要更长的转移时间。
所以为了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的DNA片段控制在大约2kb以下。
DNA的大片段必须被打成缺口以缩短其长度。
因此，通常是将电泳凝胶浸泡在0.25mol/L 的HCl溶液短暂的脱嘌呤处理之后，移至于碱性溶液中浸泡，使DNA变形并断裂形成较短的单链DNA片段，再用中性PH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。
这样，DNA片段经过碱变性作用，亦会使之保持单链状态而易于同探针分子发生杂交作用。
（二）基本步骤1. 如果靶序列>5kb，则需进行脱嘌呤处理。
(1) 把凝胶浸在0.25mol/LHCl中，室温轻轻晃动，直到溴酚蓝从蓝变黄。
注意：处理人类基因组DNA≤10分钟；处理植物基因组DNA≤20分钟。
(2) 把凝胶浸在灭菌双蒸水中2. 如果靶序列<5kb，则直接进行下面的步骤(1) 把凝胶浸在变性液（0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl）中，室温2×15分钟，轻轻晃动。
(2) 把凝胶浸在灭菌双蒸水中(3) 把凝胶浸在中和液中（0.5mol/L Tris-HCl，Ph7.5，1.5mol/L NaCl），室温2×15分钟。
(4) 在20×SSC中平衡凝胶至少10分钟。
四、转膜即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上。
而此过程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。
DNA是沿与凝胶平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此，凝胶中的DNA片段虽然在碱变性过程已经变性成单链并已断裂，转移后各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，故而称为印迹（blotting）。
用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙（Nylon）膜、化学活化膜和滤纸等，转膜时可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。
其中常用的是NC膜和Nylon膜。
各种膜的性能和使用情况比较见下表：表4－2 各种尼龙膜性能及使用情况比较表常用的Southern转膜方法有以下几种：（一）细管虹吸印迹法此法是利用浓盐酸转移缓冲液的推动作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，转移方式见图10－1：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜或尼龙膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动而滞留在膜上。
步骤：1．20×SSC浸湿一张whatman 3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，形成一个“桥”。
2．凝胶反放在浸湿的whatman 3mm滤纸上注意两者之间不能有气泡。
3．照凝胶的大小剪一张尼龙膜。
4．膜放在凝胶上。
5．尼龙膜上放一张whatman 3mm滤纸、一叠吸水纸、上置一玻璃板，其上放一重约0.2～0.5kg的物品。
6．20×SCC的转移缓冲液中充分转移18～24h及时换掉浸湿的吸水纸。
7．以下方法把DNA固定在膜上：（1）紫外交联：1）把膜（DNA面朝上）放在用2×SCC浸湿的whatman 3MM滤纸上2）把湿膜暴露在短波紫外光（254nm）下1～3分钟。
3）在无菌双蒸水中浸润膜。
4）空气中凉干膜。
（2）干燥：1）在2×SCC中短暂洗膜。
2）120℃30分钟干烤固定或80℃2h干烤固定。
8. 如果不立即进行下一步杂交反应，则可把膜保存在两张whatman 3mm滤纸之间，放在密封袋中4℃保存。
（二）电转移法此法是通过电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。
其基本方法是将滤膜与凝胶贴在一起，并将凝胶与滤膜一起置于滤纸之间，固定于凝胶支持夹，将支持夹置于盛有转移电泳缓冲液的转移电泳槽中，凝胶平面与电场方向垂直，附有滤膜的一面朝向正极。
在电场的作用下凝胶中的DNA片段向与凝胶平面垂直的方向泳动，从凝胶中移出，滞留在滤膜上形成印迹。
该法具有简单、快速、高效转移DNA的特点，尤其适用于用毛细管虹吸转移不理想的大片段DNA。
一般只需2-3h至多6-8h即可完成转移过程。
但应用这种方法需注意：不能选用硝酸纤维素膜作为固相支持物；应用循环冷却水装置以保证转移缓冲液温度不会太高；转移缓冲液不能用高盐缓冲液，以免产生强电流破坏DNA。
具体步骤如下：1. 将凝胶浸泡于1×TBE或TAE中。
2. 准备好电转移装置的凝胶支持夹裁剪4张与凝胶大小相同的Whatman 3mm滤纸和一张尼龙膜浸泡于1×TBE或TAE 中。
3. 依次将凝胶、尼龙膜、滤纸和海绵垫叠放在凝胶支持夹中，各层之间不能有气泡滞留。
4. 将凝胶支持夹安放在充满1×TBE或TAE的电转仪中。
5. 尼龙膜一侧置正极，凝胶一侧置负极，300～600mA恒流，4～8h，循环水冷却或置冷室中。
6. 电转移完毕，尼龙膜用1×TBE或TAE漂洗，用干燥滤纸吸干，80℃真空烘烤2h或短波紫外照射固定备用。
（三）真空转移法此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到置于凝胶下面的因相支持物上——尼龙膜或硝酸纤维素膜上。
真空转移法的最大优点是迅速，可在转膜的同时进行DNA变性与中和整个过程约需30～60分钟。
但在操作中应注意两个问题，一是真空压力不能太大，若压力过大，凝胶被压缩，转移效率会降低；二是真空转移液要密封严，防止漏气影响压力的产生。
下表列出了不同的印迹方法。
表10－2 不同印迹方法的比较表五、探针标记用于Southern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。
探针可以用放射性物质标记或用地高辛标记，放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。