吉西他滨对胰腺癌细胞PANC-1中survivin的诱导作用[1]

吉西他滨诱导胰腺癌细胞PANC-1 中Survivin基因表达的研究

陈俭云崔海宁

海南医学院附属医院普外科（570102）

[摘要]目的阐明化疗药物吉西他滨对胰腺癌细胞PANC-1 中survivin表达的诱导作用，探讨survivin与化疗耐药的关系。方法胰腺癌细胞株PANC-1用1640液培养，吉西他滨的浓度为1μg /ml及10µg/ml，运用RT-PCR和Western blot检测survivin的表达。分析细胞中survivin的表达水平和它对化疗耐药的关系。结果用1µg/ml及10µg/ml浓度的吉西他滨作用胰腺癌细胞株24和48小时，survivin mRNA水平分别上升1.34±0.12倍、2.40±0.17 倍和3.33±0.20 倍、4.41±0.18 倍，蛋白水平上升了1.20±0.07倍、1.48±0.19倍、2.90±0.04和4.50±0.20倍，差异有显著性意义(p＜0.05)。结论胰腺癌细胞株的化疗耐药可能通过吉西他滨的作用上调survivin的表达而增强。

[关键词]胰腺癌，survivin(存活素)，化疗耐药，吉西他滨

Study of the Survivin expression in pancreatic carcinoma cell line PANC-1 induced by gemcitabine. Chen jianyun, Cui haining. General Surgery Department of Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Cancer Research Institute of Hainan Medical College, Haikou China, 570102

[Abstract] Objective To elucidate the expression of survivin in pancreatic carcinoma cell line PANC-1 induced by chemotherapy agent (gemcitabine), and the relationship between it’s expression and the chemoresistance. Method The pancreatic carcinoma cell line PANC-1 cultured by RPMI1640, and the gemcitabine with the concentration of 1μg /ml and 10μg /ml , and survivin expression examined by RT-PCR and Western blot. Analyze the relationship of the survivin level of the cell and its chemoresistance to gemcitabine. Result24 and 48 hours after cultured by gemcitabine with the concentration of 1μg /ml and 10μg /ml, survivin mRNA level was increased 1.34±0.12、2.40±0.17、3.33±0.20、and4.41±0.18 folds, and the protein expression was enhanced 1.20±0.07、1.48±0.19、2.90±0.04 and 4.50±0.20 folds respectively,There was a significant difference between two groups (p＜0.05). Conclusion The capacity of pancreatic carcinoma cell lines chemoresistance could be enhanced by gemcitabine cultured with the survivin expression up-regulated.

[Key words] Pancreatic carcinoma, Survivin, Chemoresistance, gemcitabine

胰腺癌发病隐匿，手术切除率低，能根治者仅为5%～7.5%。约有80%以上的患者需依靠化疗和放疗等辅助治疗延长生存期。然而，大部分胰腺癌细胞对化疗药物耐药，导致胰腺癌预后极差。凋亡抑制蛋白[inhibitor of apoptosis protein,IAP]的过表达是肿瘤细胞化疗敏感性下降的重要机制。IAP是一类新的癌基因家族。目前发现的人类凋亡抑制基因共有8种，其中生存素基因[survivin]是抑制凋亡作用最强的一种[1]，本研究旨在探讨吉西他滨对胰腺癌细胞中survivin表达的诱导作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂

1.1.1 细胞株胰腺癌细胞株PANC-1购于中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。1.1.2 试剂DAB显色试剂盒购、BCA蛋白定量试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司，兔抗人Survivin多克隆抗体购自R&D公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、鼠抗人GAPDH单克隆抗体、MTT试剂均购自Sigma公司，辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG购自Pierce公司，RT试剂盒购自Promega公司，GEM为Lilly France S.A.公司产品，survivin 引物由上海博雅生物技术有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养与传代用0.25%胰酶＋0.02%EDTA的消化液消化PANC-1细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基，在37℃，含5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养；细胞每2～3天按1：3传代一次。

1.2.2 胰腺癌细胞PANC-1对化疗药物GEM的半数有效浓度(IC50)的测定(1) 细胞以3×104/孔接种于96孔板中，在37℃，含5%CO2,饱和湿度的细胞培养箱中培养24小时；(2)在各孔中均加入浓度梯度的gemcitabine，浓度分别为1000μg/ml，100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml，0.01μg/ml，0μg/ml，每个浓度设三个复孔，以不加药物的细胞存活率为100%，没有接种细胞的孔为零对照；(3) 细胞在浓度梯度药物作用下分别继续培养24和48小时，每孔加入5mg/mL的噻唑蓝(MTT)溶液20μl，37℃继续培养4小时；(4) 吸干培养基，每孔加入DMSO溶液150μl，室温摇床上振荡10分钟，使甲臜充分溶解；(5) 在用Bio-rad Model 550酶联免疫检测仪490nm波长测各孔的吸光度值；(6) 细胞增殖抑制率(%)=(1-A实验孔值/A阴性对照孔值)×100%，根据IC50计算软件得出24小时和48小时细胞对化疗药物的IC50。

1.2.3 GEM对PANC-1胰腺癌细胞内survivin的诱导细胞生长状态良好时，取1×106 /瓶传代接种于两个25cm2培养瓶中，参考IC50值，分别加入低、高浓度含1.0µg/ml和10.0µg/ml