关于内皮细胞和平滑肌细胞在微孔聚碳酸酯膜上共培养模型方法

关于内皮细胞和平滑肌细胞在微孔聚碳酸酯膜上共培养模型方法

【关键词】平滑肌细胞

关键词: 血管内皮细胞;平滑肌细胞;细胞培养;缝隙连接

摘要:目的探讨主动脉内皮细胞（EC）和平滑肌细胞（SMC）共培养模型，为下一步研究两者之间的电生理活动提供基础. 方法采用微孔聚碳酸酯膜（polycarbonate filter membrane）作为载体，将EC和SMC接种于微孔膜的两侧，建立EC和SMC联合培养模型，模拟血管壁EC和SMC间的结构关系，采用倒置显微镜和透射电镜进行观察. 结果共培养的EC和SMC组织结构关系类似于体内，EC呈单层生长，而SMC呈多层生长，同类和异类细胞间都有缝隙连接形成，缝隙

连接的形成与培养的时间有关，在SMC接种后24h，EC可以通过微孔与SMC形成缝隙连接. 结论此种EC和SMC共培养模型模拟了在体时EC和SMC之间的结构关系，可以用来研究两种细胞间的相互影响.

Keywords:vascular endothelial cells;smooth muscle cells;cell culture;gap junction

Abstract:AIM To develop a method of endothelial and smooth muscle cells co-culture by which we can study the electrophysiological

activities between two kinds of cells.METHODS Endothelial and smooth muscle cells were grown on opposite sides of microporous polycarbonate filters.The interactions between cells were examined by inverted microscopy and transmission electron microscopy.RESULTS Status of the

co-cultured cells was similar to that in vivo.Relative to the

endothelial cells monolayer，the smooth mus-cle cells were

multilayer.There were many gap-junctions a-mong the endothelial cells and smooth muscle cells respec-tively.The heterocellular gap-junctions also existed between the two kinds of cells.The number of the myoendothelial junctions had respect to the co-culturing time.After SMCs were seeded on the filter，the ECs and SMCs formed the gap junctions through the micropores within24h.CONCLUSION This new co-culture method might be a promising in vitro model for studies of interactions between endothelial and smooth muscle cells.

0 引言

血管内皮细胞（endothelial cell，EC）和平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）之间的信号转导可以通过两种方式进行:①通过细胞间的体液性信息联

系;②通过细胞间缝隙连接的接触性信息联系.前者涉及到一系列的细胞因子，由EC释放，而SMC上面有相应的受体［1］，如:内皮依赖性舒张因子（EDRF）.在

缝隙连接中，同类或异类细胞之间通过缝隙可进行离子和代谢产物的传递等.血管EC和SMC间的缝隙连接具有方向性和电荷选择性，缝隙连接的多寡在血管的不同

节段和不同的器官组织是不同的［2，3］ .这两种细胞的体液性及接触介导性信息联系对维持血管壁自身稳定有重要意义，这种信息联系的失衡可能与SMC的增生、动脉粥样硬化的发生有直接的联系［4］ .目前比较好地模仿生物体内EC和SMC关系的培养模型有微载体技术以及灌注跨毛细血管平滑肌内皮细胞共培养模型［5，6］，能够模仿体内的血流动力学环境，但其技术要求高，一般实验室不易实现.

我们采用了微孔聚碳酸酯膜作为EC和SMC共培养的载体，该模型可以模仿体内EC和SMC的组织结构关系，在此基础上，利用倒置显微镜和透射电镜观察了两种细胞的生长情况和细胞间缝隙连接情况，为下一步研究两者间的电生理活动提供了保障.

1 材料和方法

1.1 材料牛主动脉取自健康屠宰小牛;SD大鼠仔鼠（第四军医大学实验动物

中心）;1640培养基（Gibco）;加强小牛血清（Hyclone）;聚碳酸酯膜

（10mm×15mm，厚12μm，孔径5μm，孔密度2800 mm-2 ，Millipore公司）;2g L-1 明胶（Gibco）.

1.2 方法

1.2.1 牛主动脉EC（BAEC）和仔鼠SMC的分离和鉴定按我们已建立的方法培养并鉴定牛主动脉EC和仔鼠胸主动脉SMC［7］，利用2～5代细胞进行实验.

1.2.2 EC和SMC的共培养①聚碳酸酯膜的准备:取聚碳酸酯膜0.15MPa20min 高压消毒后备用，用前用明胶包被，培养箱内孵育3h，PBS浸洗后接种细胞;②共培养:按密度1×104 cm-2 将内皮细胞接种于聚碳酸酯膜的一侧，常规培养24h后翻转聚碳酸酯膜，将平滑肌细胞接种于膜的另一侧，24h后换液，以后每日换液1次，常规倒置显微镜观察，取接种后1，3和4d共培养标本进行透射电镜观察.

1.2.3 透射电镜（TEM）标本的准备［8，9］取出两侧长有细胞的聚碳酸酯膜，用预热的PBS漂洗，然后在含25g L-1 戊二醛，0.1mol L-1 二甲胂酸钠溶液（pH7）里固定1h，20℃，再用10g L-1 四氧化锇固定1h，20℃，用1g L-1 的鞣酸染色，1h，20℃，来加强对比，然后用梯度乙醇逐级脱水，之后把标本浸于乙醇-EPON（1 1）中，1h，20℃，最后用EPON-环氧树脂包埋.用刀片将包埋块切成小块，垂直细胞层作超薄切片，用150目碳包被的铜网收集，然后用100g L-1 醋酸双氧铀和4g L-1 柠檬酸铅染色.

2 结果

2.1 SMC和EC在聚碳酸酯膜上生长情况细胞在接种2h后开始在膜上贴附延