吸收曲线

题目：紫外——可见吸收曲线的测绘及维生素B12的含量测定

一、目的：

掌握紫外─可见分光光度计的原理和操作。熟悉测绘吸收曲线的一般方法。比较自动扫描型仪器与手工绘制吸收曲线的差别。掌握两种测定含量的方法。

二、原理：

维生素B12是含Co的有机物，深红色。可以用其水溶液作测量液。用与配置其水溶液相同的溶剂─本实验为水，作为参比溶液。测不同浓度下的吸光度A对C作图，得吸收曲线。也可配置好溶液后在自动扫描的仪器上自动绘制出吸收曲线。

由吸收曲线可得到VB12三个吸收峰峰位。361nm的吸收峰干扰因素少，可依朗伯—比尔定律A=E·C·L以比较法，通过测量待测液及标准溶液的吸光度。计算得到样品含量，也可以按药典规定以361±1nm处吸光系数值（207）计算得到含量。

三、仪器药品：

紫外——可见分光光度计（两种型号）比色器

VB12标准溶液VB12注射液

四、实验内容：

（一）吸收曲线绘制

吸收曲线方法一

1、将被测液与空白液分别盛装于1cm比色皿中，并置于仪器中比色皿架上，按仪器使用方

法进行操作。

2、从仪器上限开始每隔20nm测量一次吸光度在吸收峰谷的波段以5nm或更小的间隔测定

一些点

3、以波长为横坐标，吸收度为纵坐标绘图，得吸收曲线。

吸收曲线方法二

1、将被测液与空白液分别盛装于1cm比色皿中，并置于仪器中比色皿架上，按仪器使用方法进行操作。

2、按仪器使用方法操作得到吸收曲线

（二）吸光系数法测含量

取维生素B12注射液样品，按照其标示含量，精密吸取一定量，用蒸馏水准确稀释k倍，使稀释液每ml含量约为25μg，置1cm石英池中，以蒸馏水作空白，在紫外分光光度计（或有足够精度的其他仪器）上，找出361±1nm范围内的吸收峰，读取其吸光度，与48.31相乘，即得样品稀释液每ml含B12的μg数。

（三）标准比色法测含量

（1）、标准溶液取质量较好的维生素B12注射液，按上述方法去测定其实际含量，准确稀释k倍，使其每ml含B12为50-100μg，以此溶液作为标准溶液。

（2）样品溶液参照被测样品的标示含量，精确吸取适量，用蒸馏水准确稀释m倍，使其含量与标准含量接近。

（3）测定用蒸馏水为空白，用1cm玻璃吸收池在分光光度计上550nm分别测定标准溶液的吸光度（As）与样品溶液的吸光度（Ax），计算样品含量。

五、思考题：

吸收系数法中为什么吸光度乘48.31即得每毫升VB12的μg数？