安捷伦1260高效液相操作规程

安捷伦1260高效液相操作规程

安捷伦液相1260高效液相色谱

操作规程

1.前期工作

查找资料（最好是外文文献）了解别人做该样品时常用的流动相和固定相。如果还不清楚样品是什么物质，最起码也应该对其极性进行了解，为选择合适的流动相和固定相打好基础。

流动相选择注意事项：

①避免使用高粘度的溶剂作为流动相；

②所选用的流动相一定要与样品相溶；

③各流动相之间可以很好的相溶；

固定相选择注意事项：

a.正相色谱

正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2，APS）和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（Methylene Chloride）等。

b.反向色谱

反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相

对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。

2.准备工作

①用于液相色谱分析的样品溶液使用前要经过0.15µm过滤器过滤，必须达到均匀而无颗粒的状态；

②流动相一定要选用色谱级别的（最好是默克、飞世尔、时联等牌子的），并且在使用之前一定要使用0.4µm过滤器过滤，再用超声波清洗仪脱气处理20-30min；

③在连接柱子和色谱仪之前，阀件或管路一定要清洗干净，（一般用异丙醇将管路清洗）

3.仪器操作

（一）将所选择的流动相加入相应的试剂瓶中：棕色瓶对应A泵，该瓶中只能加双蒸水或娃哈哈纯净水；B、C、D泵根据需要添加。

注：若流动相中有水、乙腈最好现用现处理，不宜放置太长时间。

（二）先打开计算机登陆windows操作系统，再将仪器的泵、色谱柱、检测器打开，待计算机界面显示连接好后，双击桌面“联机”图标，进入化学工作站，从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”画面。

模块右上角状态灯颜色说明：无色，未开电源或者模块准备就绪

黄色，模块未准备就绪

绿色，正在进样分析

红色，模块出错

所有模块红色，仪器有漏液

工作站图形颜色说明：绿色，模块准备就绪

黄色，模块未准备就绪

蓝色，正在进样分析

红色，出错或者不能联机

灰色, 此模块没启用

②

等度洗脱：直接选择比；

梯度洗脱：在①中设定好初始比例，再点击②，设置一定时间内不同的比例。

方法如下:

前10min中，A：B=10:90

第10-15min中，用B:100%

第15-30min，A逐渐增加到 20%，B逐渐

（三）右击四元泵界面：

①选择“瓶填充”点击“溶剂瓶填充量”设置溶剂瓶中流动相实际体积，也可设定低体积关泵。

②旋开排气阀（逆时针），点击“方法”选项进入泵编辑的画面。将泵的流量设到5ml/min,溶剂A设到100%，打开泵，观察排出

管线中的气体，直到管线内由溶剂瓶到泵入口无其起泡为止，查看柱前压力（若大于10bar，则应更换排气阀内的过滤白头）。

依次切换到B、C、D溶剂分别排气。

（四）将泵的流速调到0.5ml/min,设定四元泵最初的溶剂比例，如A=80%，B=20%；关闭排气阀。

（五）再将流速设定到所需流量，待压力视数稳定，打开检测器灯，观察基线情况。

注：若反复几次检测器显示错误，右击“视图”中的“工作日志”“当前工作日志”查看是什么错误。

以上步骤用文字也可描述为

1)打开计算机，登陆windows操作系统。

2)打开主机各模块电源（从上至下），待各模块

完成自检后，再双击桌面“仪器1联机”图标,进入化学工作站，从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”画面。

3)把各流动相放入溶剂瓶中。

4)旋开排气阀（逆时针），右单击“四元泵”图

标出现快捷键，点击“方法”选项进入泵编辑画面。将泵流量设到5ml/min，溶剂A设到

100%，打开泵，排出管线中的气体2—3分钟，

直到管线内由溶剂瓶到泵入口无气泡为止,查看柱前压力（若大于10bar，则应更换排气阀内过滤白头）。

5)依此切换到B、C、D溶剂分别排气。

6)将泵的流量设到0.5ml/min，多元泵则再设定

溶剂配比，如A=80%，B=20%；关闭排气阀（顺时针）。

7)再将泵的流量设到0.8ml/min，2分钟后将泵

的流量设到1ml/min，冲洗色谱柱20—30分钟。

8)把缓冲液换成流动相，待柱前压力基本稳定后,

打开检测器灯，观察基线情况。

（六）编辑样品信息：由“运行控制”进入“样品信息”，设定操作者姓名，样品数据文件名等。

（七）四元泵参数设置：

（八）色谱柱设置（TCC检测器参数设置）

右击TCC模块中的空白区域，在“温度”左侧下面的方框内输入所需的温度，并选中它，右侧选中“与左侧相同”——使柱温箱的温度左右一致。

（九）VWD检测器参数设定

右键点击VWD 模块视图空白处，选择“方法”进入VWD 的参数设置界面

波长---设置VWD 检测波长

峰宽---设置为色谱图中的预期的最窄峰。峰检测器将忽略比峰宽设置窄很多或者宽很多的所有峰

停止时间---设置VWD 停止分析时间。一般设置为“与泵一致”即可

杂项---当VWD 与其他检测器一起工作或者设定冲洗色谱柱的梯度方法时，关闭检测器的灯，分析将停止。如果希望关闭检测器的灯时也能进行分析，将“采集所需的等已打开”一栏不选定即可。

时间表---此处可以变化的参数包括自动平衡、改变波长、执行扫描。

（十）进样

在设置“运行控制->样品信息”后，将手动进样阀扳至“load”状态进样(将样品装入到定量环内)。进样后，将手动进样器扳至“inject”状态，工作站自动开始记录采集数据。

分析完成后，将手动进样阀扳至“load”状态，用定量环的5 倍体积左右的甲醇清洗定量环，再在“inject”状态下清洗排空管路。清洗进样口，防止残留样品污染下次进样。

注：手不要拿注射器的针头和有样品的部位，不要有气泡，吸样时要慢、快速排出再慢吸，反复几次，10µL注射器金属针头部分体积0.6µL，有气泡也看不到，多吸1-2µL把注射器针尖朝上，气泡上走到顶端，再推动针杆排除气泡，进样的速度要快，每次进样要保持相同的速度。

（十一）在线信号检测

“视图”中打开在线信号，可以随时了解样品出峰情况。

（十二）关机