5 蛋白质化学结构研究方法

• SDS-PAGE测定分子量原理
蛋白质样品在含有DTT 、 SDS的样品处理液中 预先加热或保温处理
注意： SDS-PAGE法 测定的是亚基 或多肽分子量， 而不是天然 蛋白分子量！
浓缩胶（浓缩效应）
PAGE凝胶板
分离胶（分子筛）
•分子筛柱层析分离蛋白原理
• 结果： 依照大分子量从大 小的顺序出峰 • 若加入标准蛋白，以 Log Mr~洗脱体积， 绘制标准曲线，可测 定未知蛋白分子量
(六) 肽链的部分裂解及分离
1 肽链的部分裂解
(1) 化学法：酸解；碱解；专一性化学试剂 • CNBr裂解法： ·· Met ·· BrCN
N-端肽（Pr-高丝氨酸）+ C-端肽
作用专一性强，产率较高 ( >85%); Met-Ser(Thr)有干扰 • 羟胺裂解: 位点：-Asn—Gly副反应： -Asn — Leu-； - Asn — Ala – • NTCB(2-硝基-5-硫氰苯甲酸)裂解: 位点： 专一裂解 — Cys – 产率：> 90%
3. 电喷射电离串联质谱法 (ESI: electrospray ionization）或MS/MS法 • 蛋白溶液高压下毛细管静电分散 带电微滴
质谱仪(MS1) 寡肽 碰撞池 离子碎片（大小只相差一 个氨基酸） 质谱仪(MS2) 检测器
寡 肽
碎 片
与氮气 或氩气 碰撞
4. 通过测定核酸序列推断蛋白质序列： • DNA 序列测定较之蛋白序列测定更成熟
100C 5~10hr
肼解
FDNB NH2-CHR-CO-NHNH2 NH2-CHR-COOH(C-末端aa)
氨基酰肼二DNP衍生物 DNP-aa
乙酸乙酯
层析鉴定
抽提
• 副反应: C-端为Cys或胱氨酸时将被破坏 Met转变为甲硫氨酸亚砜 (Met-SO2)
(2)羧肽酶法:
• 从C-末端逐一向内水解， 产物为游离aa
DTT
(2)丹磺酰氯法(DNS 法)
• Dansyl-Cl法灵敏度是FDNB 法的100倍 • 反应： PH 9.5~10.5 Dansyl-Cl + Pr-NH2 DNS-Pr 酸水解 DNS-aa + aa
（0.1~1ng) 37，1hr
乙酸乙酯 抽提
聚酰胺薄膜层析
A254nm A365nm
1. Trp测定: • 碱解：上短柱 先于Lys出峰 • 酶解： 蛋白水解液 Fe 3+ 玫瑰红色化合物 （A 545nm） 2. 酰胺基的测定：温和条件下水解 浓盐酸 37℃ 10天 3. -SH的测定 2N盐酸 100 ℃ 2h (1) 硫醇盐法: Pr - SH ＋ Me﹢ Pr-s-Me+ ＋ H+ (2) 烷基化法：卤素化合物: 碘乙酸、溴乙酸及其盐类 Pr-SH S-羧甲基Cys 4. -S-S-测定：-S-S- 巯基乙醇 - SH 测定-SH数量
羧肽酶A 水解芳香族及非极性aa 不能作用于碱性aa和Pro
羧肽酶B 羧肽酶C
羧肽酶Y
专一性水解碱性aa 除Pro外的aa
水解几乎所有的aa
(五) 肽链的拆离
1.亚基拆分: ①PH改变: PH>10 ; PH<3 ②强变性剂：脲 （8M）； 盐酸胍（6M） 2.二硫键拆分 氧化: 过甲酸，不再重新生成 -S-S还原: DTT； 硫基乙醇→ 加碘乙酸等 →封闭SH 3.肽链分离和鉴定 分离: 层析 电泳 鉴定: SDS-PAGE；N-末端分析
亮氨酸氨肽酶 （LAP）
猪肾
人肝
氨肽酶M 焦谷氨酰氨肽酶
一般aa、碱性aa和Pro 专一裂解焦谷氨酰N-末端
猪肾 小牛肝
• 优点: 可连续测定N-端多个aa；条件温和 • 缺点：酶反应通常是可逆的，水解不彻底； 酶对末端aa的反应性不同，而导致判断失误
2 C-末端测定:
(1) 肼解法：
• 反应：Pr-COOH + NH2-NH2
（2）酶裂解法 * 胰蛋白酶: - Lys—，-Arg— * 胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）: Phe, Trp, Tyr— * 嗜热菌蛋白酶： — 疏水aa— * 胃蛋白酶： - 疏水aa— 疏水aa * 葡萄球菌蛋白酶（ Glu蛋白酶） - Glu— * 梭菌蛋白酶（Arg蛋白酶） - Arg— * Pro酸酶 - Pro— （3）作用位点的增减 * 马来酸酐(maleic anhydride)：保护Lys * 1, 2-环己二酮(1, 2-cyclohexanedione)：修饰Arg * 氮丙啶：修饰 Cys Lys类似物 （4） 肽片断分离纯化: 分子筛层析；电泳；高效液相色谱等
消化: Pr样品+浓H2SO4无机N（NH3 (NH4)2SO4) 蒸馏: (NH4)2SO4 + NaOH NH3 硼酸接收
滴定: HCl滴定硼酸接收到的NH3
计算: Pr含量 = 含N量 × 6.25
（2）双缩脲法：
• 原理：碱性条件下，Cu 2+与蛋白质络合，形成 紫色化合物 Pr + 碱性CuSO4溶液(双缩脲试剂) A540 • 不十分精确，但较简便、快速
3. aa定量：
柱层析(离子交换原理) • 原理： 在低PH下使aa全 部带上正电荷；再提 高PH和离子强度使结合 在柱上的aa逐步失去正 电荷而被分别洗脱下来。 解离顺序是：酸性aa 中性aa 碱性aa。 洗脱液用茚三酮显 色，定性或定量测定 • 氨基酸分析仪
(三) 蛋白中的特殊基团的测定
A259nm(紫外吸收定量)
有机溶剂抽提 层析分离
(4) 氨肽酶法:
• Pr-NH2 氨肽酶逐一内切 游离aa • 氨肽酶种类： 氨肽酶 底物及专一性 (NH2-A-B…) 酶来源
A=Leu作用最快，其次是其 它非极性aa；B=Pro时A不 人肝亮氨酸氨肽 能释放；反应需Mn2+、Mg2+ 酶（HLA）
• 待测蛋白（抗原）免疫动物 抗体
沉淀合成该蛋白的多核糖体（因含正在合成的多肽) 提取其上的mRNA 反转录合成cDNA cDNA 序列测定 结合必要的氨基酸序列，推测总氨基酸序列
4. 氨基酸自动分析仪：原理为Edman降解法
(八) 一级结构复现：
• 重叠肽(overlaping peptide)或接头肽： 不同的断裂方法得到的相互跨过切口而重叠的肽段。
(九) 二硫桥及酰胺键定位
• 酰胺键的定位：蛋白 酶解 分离含单一Asx或Glx片段
分别测序 比照定位 • -S-S-位置的确定： 蛋白 酶解 对角线电泳分离参与形成-S-S-片段 纯化 分别测序 比照定位
(七) 肽片断中aa的序列测定：
1. Edman化学降解法（PITC法，异硫氰酸苯酯法）:
产物：PTH-aa 紫外吸收测定 可连续测定：10~15aa 2. DABITC法： 4-N, N-二甲基 氨基偶氮苯-4-异硫氰酸酯 产物：DABTH-aa（经HCl 熏后 红色） 3. 酶法：氨肽酶，羧肽酶，外肽二肽酶
第一节 蛋白质化学结构的测定 一 前言
二 蛋白质一级结构测定的程序
(一) 蛋白质的分离、纯化与鉴定:
生物体材料 结晶或冻干粉
破碎，溶解， 离心分离 无细胞抽提液
除核酸 溶解度分级法 等电点沉淀 细胞器或膜 释放膜蛋白 各种层析、电泳，配合超滤 纯化蛋白
1. 蛋白的浓度测定：
（1）凯氏定氮法：测样品中N含量，较精确 • 步骤：
（3）Folin-酚试剂(Lowry法)：
• 原理：第一步是双缩脲反应，形成的络合物再还 原磷钼酸-磷钨酸（ Folin-酚试剂），得到深蓝色 化合物。 Pr（Tyr，Trp）+ Folin-酚试剂 A500 A液：NaCO3的NaOH液 + CuSO4的酒石酸钾液 B液：钨酸钠 + 钼酸钠
• 是蛋白质标准测定方法。灵敏，浓度范围： 20~400g/ml
对角线电泳示意图
+
• 点样 • 第一向电泳（水平方向） • 过甲酸处理样品点
• 第二向电泳（垂直方向）
• 分析，提纯 • 分别测序
-
-
+
S S
五 一级结构测定研究进展:
1. Edman降解试剂和方法改进
2. 序列仪设计上的改进和创新
• 氨基酸自动分析:
液相：连续测定20 ~50个aa； 5nmol；不适用小肽 固相：肽-固相载体（得率低）， 适用于疏水性肽及小肽（<30个aa） 气相：测55个aa；重复率98%；最底样品量5pmol
• 密度梯度超离心分离蛋白原理
• 可用于分离、纯化和测定蛋白质或其它生 物大分子的相对分子质量。
• s ：沉降系(常) 数：单位离心场的沉降速度。 • 沉降系数单位：1 S(斯维得贝格)= 10-13秒 • 沉降速率法(sedimentation velocity): 梯度溶液(蔗糖,甘油等)的密度 蛋白质 密度 • 沉降平衡法(sedimentation equilibrium): 梯度溶液(CsCl等)的密度 蛋白质密度
（4）紫外吸收法： A280比色
（5）染料结合法（Bradford法）： 灵敏度较高, g水平。 染料：考马斯亮蓝等
2. 蛋白质的纯度鉴定 (>97%) ：
•
• •
电泳（SDS-PAGE) 层析( 包括HPLC) N-末端分析等
3. 蛋白质分子量测定: 误差<10%
1）平均分子量计算： • 化学分子量：根据化学分析结果计算最小分子量 方法：根据氨基酸滴定分析、蛋白质中特殊基团含量 或 化学元素组成计算最小分子量 要求：样品均一，否则只能计算平均分子量 2）物理分子量测定：根据蛋白质物理化学性质测源自文库分子量 曾用方法：渗透压法、黏度法、光散射、薄板层析、 目前常用方法： SDS-PAGE、分子筛凝胶层析、超离心
(二) 蛋白和肽的aa组成的测定： 1.蛋白水解: 酸解法；碱解法；酶解法
5.7N恒沸HCL
①Trp100%被破坏 ③Asn Gln → Asp Glu ④Ser Thr Tyr Lys部分破坏
酸解：Pr溶液 105-110℃ 20-72h ②二硫键解离
2. aa定性： 纸层析；硅胶薄板层析；高压纸电泳
• 反应: S=C=N-C6H5+NH2-Prn
酸性
环化脱落 PH8~9 40~50C
S Prn -NH-C-NHC6H5
(PTC-Pr )
NH2-Prn-1 + R-CH-C=O
+HN
R-CH-C=O
HN N - C6H5 C S
(PTH-aa)
S
可连续测定 10肽
C HN-C6H5
噻唑啉酮衍生物(不稳定)
黄色荧光
• 副反应： Dansyl-Cl过量时生成DNS-NH2 （绿色荧光）和DNS-OH CH3 –N- CH3 部分DNS-aa酸解后破坏，破坏率： DNS-Pro（77%）； DNS-Ser （35%）； DNS-Gly（18%）； DNS-Ala （7%）
O=S =O Cl
(3) 苯异硫氰酸酯(PITC法)