病毒学检验重点

病毒学检验重点 Prepared on 22 November 2020

病毒的特点：

1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。

2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质

3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA）

4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸

5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒

6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性

7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力

8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染

体外细胞培养的基本条件：

1、条件要求高，培养液组分复杂，需要添加血清才能满足生长需要

2、避免微生物污染，需要在培养液中加入抗生素。

3、体外细胞培养的基本要求主要包括细胞接种（尽量选择对数期细胞接种）、

4、培养液营养成分、

5、酸碱度（能耐受的ph范围为，依靠缓冲系统调节）、

6、气体条件（细胞生长需要CO2 ，大规模培养需要有足够的氧气）、

7、温度（最适温度为35-37。C）、

8、水的纯度（一般要求去离子水或三蒸水）、

9、无菌条件等

实验动物的微生物控制分类：

1、普通动物，一级动物，要求不携带动物烈性传染病和人兽共患病

病原

2、清洁动物，二级动物，在一级动物要求上，不携带对动物危害

大、对实验干扰大的病原体，外观健康，主要器官不得有组织病理学病

变

3、无特定病原体动物，三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带

病原体外，还要求排除潜在感染或条件致病菌的感染

4、无菌动物，四级动物，要求在体内外不得检出其它生命体

实验动物的遗传学分类

1、近交系，指经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育的动物品系

2、封闭系，不从外界引入新的血缘，非近亲交配方式的实验动物群

体

3、突变系，由于遗传基因发生突变而具有某些特殊形状的动物

4、杂交群动物，由不同品系杂交所产生的后代

5、转基因动物，插入外源基因后能正常繁殖的动物

大鼠、小鼠的采血方法

1、剪尾采血，动物麻醉后，将尾端剪去约5mm，待血液流出采集，

小鼠可每次采血，大鼠约

2、眼眶后静脉丛采血，拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤固定，轻

轻压迫颈部两侧，使眼球充分外凸。采血管插入眼角与眼球之间，向眼

底方向刺入，切开静脉丛，血流即流入取血管。

3、颈（股）动脉或颈（股）静脉采血，麻醉动物，剪去被毛，作颈

静脉或劲动脉分离术后采血

4、摘眼球采血，采血时，用左手固定动物，压迫眼球，尽量使眼球

凸出，右手用弯头镊子摘除眼球，迅速采集血液

病毒的纯化方法：

一般原则释放病毒至细胞外、去除细胞碎块、病毒悬液浓缩

1、PEG浓缩法，包括直接加入法、液体浓缩法、固体浓缩法

2、超过滤法

3、吸附法，有凝胶吸附法、红细胞吸附法

4、超速离心法

中和试验及其应用

是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力的一种方法。通常以100TCID50/单位体积或100LD50/单位体积作为标准的病毒试验浓度

1、鉴定病毒、

2、分析病毒抗原的性质、

3、测定免疫血清的抗体效价和疫苗接种后的效果、

4、测定病人血清中的抗体，用于诊断病毒性疾病

鸡胚培养的优缺点

优点

1、组织分化程度低，病毒易于繁殖

2、来源充足，其本身很少携带病毒和细菌，敏感范围广，对接种的

病毒不产生抗体

3、有神经血管的分布和脏器的构造

缺点

1、与除引起鸡胚死亡的病毒及产生痘疱的病毒外，通常不产生特异

性的感染指症，必须通过另外的实验来证明病毒的存在

2、鸡食入的抗生素会使某些病原体的繁殖收到抑制

3、某些细菌和病毒能够从感染的鸡传递到鸡胚

PCR（聚合酶链反应）基本反应体系和步骤

反应体系：需要扩增的模板、与DNA靶序列3’末端互补的合成引物、4种三磷酸脱氧核糖核苷酸dNTP、耐热DNA聚合酶、合适的缓冲液体系。

基本步骤与反应：

1、变性，将反应体系混合物加热至94C，维持约30~60秒，使待测双链DNA 变性解链为单链模板。

2、2、退火，冷却至特定的温度（引物的Tm值左右，一般为45~65C），一对寡糖核苷酸引物分别与正、负单链DNA序列两端互补结合。

3、延伸，将温度提高至72C并维持一段时间，引物在聚合酶作用下，以3端为起点，4种dNTP为原料，按碱基配对原则，沿5→3方向延伸，合成两条新DNA链。

基因克隆以及基本步骤：

利用酶将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割、重组连接、组成新的DNA重组子，导入宿主细胞，随着宿主细胞的繁殖从而得到大量自带DNA重组子或其表达产物。

基本步骤：

1、分离或合成目的基因

2、将目的基因在体外插入载体形成重组DNA

3、将重组DNA导入宿主细胞

4、重组体的筛选、鉴定和分析

乙肝病人血清学检测的五项指标：

HBsAg（表面抗原）、抗-HBs（表面抗体）、抗-HBc（核心抗体）、HBeAg（e抗原）、抗-HBe（e抗体）

乙肝病毒血清学检查三种主要抗体及其意义

1、抗-HBe一般存在于无症状HBV携带者及活动期慢性肝炎患者中。

2、抗-HBs：是HBsAg刺激机体产生的特异性中和抗体，是保护性抗体。阳性表明机体已经产生免疫力

3、抗-HBc：包括抗-HBcIgM、抗-HbcIgG，前者是急性感染的重要指标，也是慢性活动肝炎的重要标志。阳性主要见于乙肝恢复期，慢性感染和既往感染。

空斑形成单位（PFUs）试验：是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时，会造成细胞被溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒所造成，计算空斑数目再乘以稀释倍数，即可得知原来的病毒感染单位的浓度。凡是能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可用空斑技术来测定其滴度。

50%终点法：是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞，将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线，找出造成50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。

ID50：即是指可造成50%动物或鸡胚感染的剂量