CT26结肠癌耐药动物模型
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设检验水准 α=0.05，统计软件使用 SPSS11.5，两组数据 比较，计量资料的 t 检验，P<0.05。
2结果
2.1 对照组与实验组肿瘤生长情况 B 超显示对照组开始化疗后第 21 d 肿瘤生长情况，平均
肿瘤体积（0.63±0.11）cm3，100 %成瘤，彩超显示肿瘤血供丰 富（图 1），第 47 d 时开始出现死亡。实验组于开始化疗后第 21 dB 超未探及肿瘤，化疗后第 35 dB 超显示肿瘤体积（0.48±0.09） cm3。化疗第 49 d，肿瘤体积达到（1.62±0.34）cm3 时开始生长 迅速。小鼠毛发仍较光泽，体重无明显下降，活动度可。化疗 后第 91 d 肿瘤体积（8.76±2.17）cm3。化疗第 91 d，小鼠活动 度明显降低，包块增大明显，毛发稀疏零乱，肿瘤体积大，不 能完整剥离，肉眼可见肿瘤中央明显的出血坏死区域，无 1 例死亡。 2.2 生长曲线和倍增时间
DOI:10.13406/j.cnki.cyxb.2010.08.036
— 1224 —
重庆医科大学学报 2010 年第 35 卷第 8 期 （Journal of Chongqing Me dical Unive rs ity 2010. Vol.35 No.8）
技术与方法 文章编号：0253- 3626（2010）06- 1224- 03
分别取生长状态良好的 CT26、CT26/5- Fu/ADM（化疗后 91 d 肿瘤细胞），胰酶消化制备成单细胞悬液，浓度调整 5× 104 个/ml，接种到 96 孔板中（每孔 100 μl），于 490 nm 处检 测各孔的吸光值（OD 值），连续观察 7 d，实验重复 3 次。以培 养时间为横轴，吸光值为纵轴，绘制生长曲线，计算细胞倍增 时间。 1.3 MTT 法检测化疗前后肿瘤细胞对化疗药物的敏感性
重庆医科大学学报 2010 年第 35 卷第 8 期 （Journal of Chongqing Me dical Unive rs ity 2010. Vol.35 No.8）
— 1225 —
1 材料与方法
1.1 建立小鼠结肠癌细胞株 CT26 的肿瘤模型及化疗药物 诱导耐药
CT26 小鼠结肠癌细胞株由华西医科大学馈赠，Balb/c 小 鼠购于重庆医科大学动物中心，实验分为实验组和对照组， 每组 7 只，每只接种肿瘤细胞数为 5×105 个，接种部位为右 腋下。接种后第 3 d 对照组给予生理盐水腹腔注射作对照。 而实验组给予化疗药物，5- Fu（上海旭东海普药业有限公司） 0.1 mg/g 腹腔注射，连续 5 d 后间歇一周为一个疗程，连用两 个疗程后改用 ADM（Pharmacia Italia S.P.A）0.01 mg/g，腹腔注 射，每 3 周 1 次。 1.2 生长曲线及倍增时间测定
【文献标识码】A
【收稿日期】2009- 03- 02
Es tablis hme nt of multidrug re s is tant animal mode l in mice CT26 colon cance r ce lls
GUI Lin-ling，et al （Department of Pediatrie Surgery，Children’s Hospital，Chongqing Medical University）
小鼠 CT26 结肠癌耐药动物模型的建立
桂琳玲，金先庆，罗 庆
（重庆医科大学附属儿童医院普外科，重庆 400014）
【摘 要】目的：化疗药物诱导建立小鼠 CT26 结肠癌多药耐药（Multidrug resistance，MDR）动物模型。方法：建立小鼠 CT26 结肠
癌皮下肿瘤模型，5- 氟尿嘧啶和阿霉素联合化疗，MTT 法绘制化疗前后细胞株的生长曲线、计算倍增时间及对各化疗药物敏感
各化疗药物最大浓度为：ADM 1 mg/ml、VCR 10μg/ml、 5- Fu 1 mg/ml、HCPT 0.1μg/ml、DAM1 mg/ml、ACT 0.1 mg/ml、 VP16 0.01 mg/ml 分别按 10 倍比例稀释成 5 个浓度梯度。 MTT 法分别检测 CT26、CT26/5- Fu/ADM细胞对 ADM、5- Fu、 VCR 等药物的敏感性。MTT 法测定肿瘤细胞增值抑制率，计 算耐药指数（Resistance index，RI）。 1.4 RT-PCR 检测化疗前后肿瘤组织与外周血单个核细胞 MDR1b mRNA 表达 1.4.1 引物设计 引物根据已知的 MDR1b mRNA 序列设计 并合成一对扩增引物，PCR 扩增产物 196 bp，上游引物： 5- GCC AAA ATA ACA AGG GTT AGC TT- 3，下游引物：5TGC GAC AGC AGA TAG GCT G- 3。选用 GAPDH 作内参照， PCR 扩增产物 439 bp，GAPDH 上游引物：5- AGC AGT CCC GTA CAC TGG CAA A- 3，GAPDH 下游引物：5- TCT GTA GTG ATG TAA ATG TCC TCT- 3。以上引物由重庆鼎国生物科技有 限公司合成。 1.4.2 RT- PCR Total RNA 提取试剂 TaKaRa RNAiso Reagent 购于宝生物工程（大连）有限公司，按试剂说明书提取总RNA， 紫外光分光光度仪检测总 RNA 含量。ReverTra Ace- α- TM
肿瘤细胞多药耐药（Multidrug resistant，MDR）的主要原 因应归于一个高度保守（从细菌到人类）的跨膜蛋白家族某 些成员的过度表达，这个家族以 ATP 结合盒（ATP- binding cassette，ABC）为特征，因此称为 ABC 转运蛋白超家族。ABC 转运蛋白超家族是人类最大的转运蛋白基因家族，编码产物 是一组跨膜蛋白，即 ABC 转运蛋白，ABC 转运蛋白在细胞的 生长发育过程中起着重要的作用[1]。
横坐标代表天数，纵坐标代表 MTT 测得光密度值，根据 公式计算获得化疗前后肿瘤细胞的倍增时间分别为（64.8± 4.2）h 和（70.6±5.17）h，（t=1.2，P>0.05）化疗前后肿瘤细胞 倍增时间有差异（图 2）。 2.3 MTT 检测未化疗和化疗 91 d 后肿瘤细胞对化疗药物敏 感性及对应化疗药物的 RI
提取化疗前后原代培养的肿瘤细胞 1×106 个/ml，加柔 红 霉 素 终 浓 度 7.5μg/ml，37℃ 5 % CO2 培 养 箱 内 孵 育 30 min，1 500 r/min，弃培养基，无血清的 D/F12 培养基洗 1 次， 加异搏定终浓度 10μg/ml，终止泵功能，孵育 10 min，1 500 r， 5 min，弃培养基，加 PBS 1 ml，于流式细胞仪上检测，吸光值 570 nm。 1.6 统计学处理
逆转录试剂盒购于东洋纺（上海）生物科技有限公司。按试剂 说明书操作。2×HotStart TaqPCR master Mix 购于天根生物科 技（北京）有限公司。将 MDR1b mRNA 与 GAPDH mRNA 的 PCR 产物的吸光度比值定义为 MDR1b mRNA 的相对强度。 1.5 流式检测柔红霉素排出情况
5.8、3.0、2.8，敏感性降低。耐药株 MDR1b mRNA 表达水平比亲本细胞株高，对柔红霉素的外排能力明显高于亲本细胞株。结论：本
实验成功建立肿瘤多药耐药的动物模型，为化疗后肿瘤继发多药耐药问题的研究提供动物模型，为提高化疗效果研究奠定基础。
【关键词】多药耐药；动物模型；化疗
wenku.baidu.com
【中国图书分类法分类号】R73- 3
【Abstract】Objective：To establish the multidrug resistant animal model of CT26 colon cancer cells in mice with the use of chemotherapy. Methods：CT26 colon cancer cells were injected subcutaneously into the right oxters of the mice. Fluorouracil and doxorubicin were combined into chemotherapy. Drown growth curve and calculate doubling generation time，chemotherapeutics drug sensitivity and drug fast index number of the tumor cells before and after chemotherapy were evaluated by MTT method. Levels of MDR1b mRNA were measured by RT- PCR. Eliminate function of P- gp were measured by flow cytometer. Results：Doubling generation time of the persister was higher than the parent cells. Drug resistance indexes were 29.3，26.4，10.9，7.0，5.8，3.0、and 2.8 respectively to ACT，ADM，VCR，HCPT，5- Fu， DAM，and VP16 after chemotherapy and the drug sensitivity were lower .The levels of MDR1b mRNA increased after chemotherapy and P- gp excretive ability was higher than that of no chemotherapy group. Conclusion：The multidrug resistant animal model has established successfully，which provided animal model for our study and research in the acquired multidrug resistance，and established groundwork for the research in increasing the chemotherapy effect. 【Key words】Drug resistance；Animal model；Chemotherapy
MDR 分为原发耐药和继发耐药，继发耐药是指患者在 初次接受化疗药物时敏感，以后对原药产生耐药并对同类或 作者介绍：桂琳玲（1982-），女，硕士，
研究方向：肿瘤。 通讯作者：金先庆，男，教授，E-mail：etzhl@163.com。
其他类药物产生交叉耐药，其治疗效果递减，称为继发耐药， 原发性耐药和继发性耐药是目前某些临床化疗治疗肿瘤疗 效差的重要原因之一[2]。
大量的研究表明肿瘤患者在接受化疗药物治疗以后肿 瘤细胞中的 P- gp（ABC 转运蛋白之一）表达明显增高。在急 性髓细胞性白血病诊断时 P- gp 的表达只有 30％。但在化疗 药物治疗后复发的 白 血 病 的 患 者 中 其 P- gp 的 表 达 大 于 50％[3]。P- gp 过表达的肿瘤与患者存活率下降及预后差有相 关性[4]。本试验通过建立体内化疗诱导 MDR的动物模型，探 讨肿瘤细胞继发性耐药的生物学特征，为 MDR的逆转及如 何提高化疗药物疗效提供研究基础。
性及耐药指数（Resistance index，RI），RT- PCR 检测化疗前后 MDR1b mRNA 表达情况，流式细胞技 术检测多药耐药蛋白
（P- glycoprotein，P- gp）外排功能。结果：耐药株的倍增时间比亲本细胞株长，化疗后肿瘤对放线菌素 D（ACT）、阿霉素（ADM）、长
春新碱（VCR）、羟基喜树碱（HCPT）、5- 氟尿嘧啶（5- Fu）、柔红霉素（DAM）、依托泊甙（VP16）的 RI 分别为 29.3、26.4、10.9、7.0、
2结果
2.1 对照组与实验组肿瘤生长情况 B 超显示对照组开始化疗后第 21 d 肿瘤生长情况，平均
肿瘤体积（0.63±0.11）cm3，100 %成瘤，彩超显示肿瘤血供丰 富（图 1），第 47 d 时开始出现死亡。实验组于开始化疗后第 21 dB 超未探及肿瘤，化疗后第 35 dB 超显示肿瘤体积（0.48±0.09） cm3。化疗第 49 d，肿瘤体积达到（1.62±0.34）cm3 时开始生长 迅速。小鼠毛发仍较光泽，体重无明显下降，活动度可。化疗 后第 91 d 肿瘤体积（8.76±2.17）cm3。化疗第 91 d，小鼠活动 度明显降低，包块增大明显，毛发稀疏零乱，肿瘤体积大，不 能完整剥离，肉眼可见肿瘤中央明显的出血坏死区域，无 1 例死亡。 2.2 生长曲线和倍增时间
DOI:10.13406/j.cnki.cyxb.2010.08.036
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重庆医科大学学报 2010 年第 35 卷第 8 期 （Journal of Chongqing Me dical Unive rs ity 2010. Vol.35 No.8）
技术与方法 文章编号：0253- 3626（2010）06- 1224- 03
分别取生长状态良好的 CT26、CT26/5- Fu/ADM（化疗后 91 d 肿瘤细胞），胰酶消化制备成单细胞悬液，浓度调整 5× 104 个/ml，接种到 96 孔板中（每孔 100 μl），于 490 nm 处检 测各孔的吸光值（OD 值），连续观察 7 d，实验重复 3 次。以培 养时间为横轴，吸光值为纵轴，绘制生长曲线，计算细胞倍增 时间。 1.3 MTT 法检测化疗前后肿瘤细胞对化疗药物的敏感性
重庆医科大学学报 2010 年第 35 卷第 8 期 （Journal of Chongqing Me dical Unive rs ity 2010. Vol.35 No.8）
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1 材料与方法
1.1 建立小鼠结肠癌细胞株 CT26 的肿瘤模型及化疗药物 诱导耐药
CT26 小鼠结肠癌细胞株由华西医科大学馈赠，Balb/c 小 鼠购于重庆医科大学动物中心，实验分为实验组和对照组， 每组 7 只，每只接种肿瘤细胞数为 5×105 个，接种部位为右 腋下。接种后第 3 d 对照组给予生理盐水腹腔注射作对照。 而实验组给予化疗药物，5- Fu（上海旭东海普药业有限公司） 0.1 mg/g 腹腔注射，连续 5 d 后间歇一周为一个疗程，连用两 个疗程后改用 ADM（Pharmacia Italia S.P.A）0.01 mg/g，腹腔注 射，每 3 周 1 次。 1.2 生长曲线及倍增时间测定
【文献标识码】A
【收稿日期】2009- 03- 02
Es tablis hme nt of multidrug re s is tant animal mode l in mice CT26 colon cance r ce lls
GUI Lin-ling，et al （Department of Pediatrie Surgery，Children’s Hospital，Chongqing Medical University）
小鼠 CT26 结肠癌耐药动物模型的建立
桂琳玲，金先庆，罗 庆
（重庆医科大学附属儿童医院普外科，重庆 400014）
【摘 要】目的：化疗药物诱导建立小鼠 CT26 结肠癌多药耐药（Multidrug resistance，MDR）动物模型。方法：建立小鼠 CT26 结肠
癌皮下肿瘤模型，5- 氟尿嘧啶和阿霉素联合化疗，MTT 法绘制化疗前后细胞株的生长曲线、计算倍增时间及对各化疗药物敏感
各化疗药物最大浓度为：ADM 1 mg/ml、VCR 10μg/ml、 5- Fu 1 mg/ml、HCPT 0.1μg/ml、DAM1 mg/ml、ACT 0.1 mg/ml、 VP16 0.01 mg/ml 分别按 10 倍比例稀释成 5 个浓度梯度。 MTT 法分别检测 CT26、CT26/5- Fu/ADM细胞对 ADM、5- Fu、 VCR 等药物的敏感性。MTT 法测定肿瘤细胞增值抑制率，计 算耐药指数（Resistance index，RI）。 1.4 RT-PCR 检测化疗前后肿瘤组织与外周血单个核细胞 MDR1b mRNA 表达 1.4.1 引物设计 引物根据已知的 MDR1b mRNA 序列设计 并合成一对扩增引物，PCR 扩增产物 196 bp，上游引物： 5- GCC AAA ATA ACA AGG GTT AGC TT- 3，下游引物：5TGC GAC AGC AGA TAG GCT G- 3。选用 GAPDH 作内参照， PCR 扩增产物 439 bp，GAPDH 上游引物：5- AGC AGT CCC GTA CAC TGG CAA A- 3，GAPDH 下游引物：5- TCT GTA GTG ATG TAA ATG TCC TCT- 3。以上引物由重庆鼎国生物科技有 限公司合成。 1.4.2 RT- PCR Total RNA 提取试剂 TaKaRa RNAiso Reagent 购于宝生物工程（大连）有限公司，按试剂说明书提取总RNA， 紫外光分光光度仪检测总 RNA 含量。ReverTra Ace- α- TM
肿瘤细胞多药耐药（Multidrug resistant，MDR）的主要原 因应归于一个高度保守（从细菌到人类）的跨膜蛋白家族某 些成员的过度表达，这个家族以 ATP 结合盒（ATP- binding cassette，ABC）为特征，因此称为 ABC 转运蛋白超家族。ABC 转运蛋白超家族是人类最大的转运蛋白基因家族，编码产物 是一组跨膜蛋白，即 ABC 转运蛋白，ABC 转运蛋白在细胞的 生长发育过程中起着重要的作用[1]。
横坐标代表天数，纵坐标代表 MTT 测得光密度值，根据 公式计算获得化疗前后肿瘤细胞的倍增时间分别为（64.8± 4.2）h 和（70.6±5.17）h，（t=1.2，P>0.05）化疗前后肿瘤细胞 倍增时间有差异（图 2）。 2.3 MTT 检测未化疗和化疗 91 d 后肿瘤细胞对化疗药物敏 感性及对应化疗药物的 RI
提取化疗前后原代培养的肿瘤细胞 1×106 个/ml，加柔 红 霉 素 终 浓 度 7.5μg/ml，37℃ 5 % CO2 培 养 箱 内 孵 育 30 min，1 500 r/min，弃培养基，无血清的 D/F12 培养基洗 1 次， 加异搏定终浓度 10μg/ml，终止泵功能，孵育 10 min，1 500 r， 5 min，弃培养基，加 PBS 1 ml，于流式细胞仪上检测，吸光值 570 nm。 1.6 统计学处理
逆转录试剂盒购于东洋纺（上海）生物科技有限公司。按试剂 说明书操作。2×HotStart TaqPCR master Mix 购于天根生物科 技（北京）有限公司。将 MDR1b mRNA 与 GAPDH mRNA 的 PCR 产物的吸光度比值定义为 MDR1b mRNA 的相对强度。 1.5 流式检测柔红霉素排出情况
5.8、3.0、2.8，敏感性降低。耐药株 MDR1b mRNA 表达水平比亲本细胞株高，对柔红霉素的外排能力明显高于亲本细胞株。结论：本
实验成功建立肿瘤多药耐药的动物模型，为化疗后肿瘤继发多药耐药问题的研究提供动物模型，为提高化疗效果研究奠定基础。
【关键词】多药耐药；动物模型；化疗
wenku.baidu.com
【中国图书分类法分类号】R73- 3
【Abstract】Objective：To establish the multidrug resistant animal model of CT26 colon cancer cells in mice with the use of chemotherapy. Methods：CT26 colon cancer cells were injected subcutaneously into the right oxters of the mice. Fluorouracil and doxorubicin were combined into chemotherapy. Drown growth curve and calculate doubling generation time，chemotherapeutics drug sensitivity and drug fast index number of the tumor cells before and after chemotherapy were evaluated by MTT method. Levels of MDR1b mRNA were measured by RT- PCR. Eliminate function of P- gp were measured by flow cytometer. Results：Doubling generation time of the persister was higher than the parent cells. Drug resistance indexes were 29.3，26.4，10.9，7.0，5.8，3.0、and 2.8 respectively to ACT，ADM，VCR，HCPT，5- Fu， DAM，and VP16 after chemotherapy and the drug sensitivity were lower .The levels of MDR1b mRNA increased after chemotherapy and P- gp excretive ability was higher than that of no chemotherapy group. Conclusion：The multidrug resistant animal model has established successfully，which provided animal model for our study and research in the acquired multidrug resistance，and established groundwork for the research in increasing the chemotherapy effect. 【Key words】Drug resistance；Animal model；Chemotherapy
MDR 分为原发耐药和继发耐药，继发耐药是指患者在 初次接受化疗药物时敏感，以后对原药产生耐药并对同类或 作者介绍：桂琳玲（1982-），女，硕士，
研究方向：肿瘤。 通讯作者：金先庆，男，教授，E-mail：etzhl@163.com。
其他类药物产生交叉耐药，其治疗效果递减，称为继发耐药， 原发性耐药和继发性耐药是目前某些临床化疗治疗肿瘤疗 效差的重要原因之一[2]。
大量的研究表明肿瘤患者在接受化疗药物治疗以后肿 瘤细胞中的 P- gp（ABC 转运蛋白之一）表达明显增高。在急 性髓细胞性白血病诊断时 P- gp 的表达只有 30％。但在化疗 药物治疗后复发的 白 血 病 的 患 者 中 其 P- gp 的 表 达 大 于 50％[3]。P- gp 过表达的肿瘤与患者存活率下降及预后差有相 关性[4]。本试验通过建立体内化疗诱导 MDR的动物模型，探 讨肿瘤细胞继发性耐药的生物学特征，为 MDR的逆转及如 何提高化疗药物疗效提供研究基础。
性及耐药指数（Resistance index，RI），RT- PCR 检测化疗前后 MDR1b mRNA 表达情况，流式细胞技 术检测多药耐药蛋白
（P- glycoprotein，P- gp）外排功能。结果：耐药株的倍增时间比亲本细胞株长，化疗后肿瘤对放线菌素 D（ACT）、阿霉素（ADM）、长
春新碱（VCR）、羟基喜树碱（HCPT）、5- 氟尿嘧啶（5- Fu）、柔红霉素（DAM）、依托泊甙（VP16）的 RI 分别为 29.3、26.4、10.9、7.0、