细胞系或细胞株的建立
细胞工程原理-第一章 动物细胞的培养
（二）合成培养基
主要是指通过人工设计、配制而成的，使用时需 添加一定量血清的一类培养基，可在体外较好用 于动物细胞培养。目前已经设计出适合不同类型 细胞的培养基，如DMEM、TC199等。 优点：创制出与体内相似的生存环境，又便于控 制，实现标准化。
主要成分：氨基酸、糖、无机盐、维生素及其他 辅助物质。
定 1.鉴定指标 ① 纯度： 何种细胞为主 ② 细胞学特征： 细胞形态、结构、染色体组型、生长曲线、分 裂指数、倍增时间等
③ 稳定性：传代过程中，细胞学特征是否发生变化 ④ 污染情况： 是否有微生物和其他细胞系污染
2.鉴定方法
① 细胞形态学观察： 光镜和电镜观察形态特征 ② 绘制生长曲线，计算分裂指数 ③ 进行染色体组型和带型分析 ④ 检测同工酶酶谱
人心肌成纤维细胞 成纤维细胞
人乳腺
（3）游走细胞型
特点：细胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游 走或变形运动，一般不连接成片。 举例：人单核细胞、巨噬细胞以及某些肿 瘤细胞。
人单核细胞
（4）多行型细胞
特点：呈多角形，是一些形态上不规则的细胞 ，不规则形态是由宽扁的胞质突起所致，细胞 一举般 例分 ：胞 神体 经和 元胞细突胞两、部神分经。胶质细胞。
（一）细胞的冷冻保存
细胞超低温保存的基本原理：细胞在-70℃以下时 ，细胞内的酶活性降低，代谢处于完全停止状态 ，故可长期保存。
细胞低温保存的关键：通过-20-0℃阶段的处理过 程。因为在此温度范围内，易造成细胞的严重损 伤，因此，常常在培养液中加入保护剂来减少对 细胞的伤害。
细胞冷冻过程：将对数期细胞用冻存液（DMSO+血 清或者+培养基+血清）、甘油+血清等）重悬，分
（二）建立细胞系、株
细胞的换液与传代
（三）克隆的分离
克 隆 化 环 分 离 法
❖ 2、射线照射分离克隆法
将培养瓶倒置放于X射线或 钴60源下，用2mm厚的铅片盖住选中的克隆。
❖ 3、悬浮细胞克隆分离 ❖ 24孔板加入1ml培养液—用毛细吸管吸取群
三 、细胞克隆
❖ 细胞克隆（clone）是指单个细胞通过有丝分裂形 成的细胞群体，他们的遗传特性相同。
❖ 细胞克隆化培养（cell cloning culture）：又称单 个细胞分离培养，是指将单个细胞在一定支持物上 增殖培养而产生细胞群落的过程。
（一）克隆培养技术
分类：
稀释铺板法 饲养层克隆法 胶原膜板 琼脂克隆法等
离心法：离心后去上清，加培养液，吹 打， 传代。 直接传代法：将细胞慢慢沉淀，将上清吸去 1/2-2/3，加培养基，传代。
(二) 传代培养的注意事项
1、传代时机与传代培养的细胞密度：细胞没生长 到足以覆盖的瓶底壁的大部分表面前，不要急于传 代。 2、传代数或代数：指对培养物传代的次数。 3、尽量少传代，避免转化。
在 琼 脂 基 底 上 用 甲 基 纤 维 素 克 隆 化 图 解
（二）影响克隆形成率的因素
❖ 克隆形成率 (cloning efficiency)是指向底物 接种单细胞悬液能形成细胞小群的百分数
❖ 影响因素：
1、细胞密度。10个/ml
2、培养液。HamF12k
3、血清
4、饲养细胞
5、激素和生长因子：胰岛素，地塞米松，EGF，BFGF。
一、传代培养（passage）
❖ 概念：无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移 或移植到另一个培养瓶。
细胞系或细胞株的建立
、概念、概念1、细胞系（Cell Line）：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineag e of Cells）所组成。
2、细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。
细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。
如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitec ell strain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continu ous cell strain）。
对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。
二、建立细胞系（或株）的要求什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。
对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做如下说明：1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；个体性别、年龄；取材的器官或组织。
如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。
2、细胞生物学检测：了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。
如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。
3、培养条件和方法；应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜P H值。
三、若干细胞建株的要点及基本过程（一）肿瘤细胞培养技术要点1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。
取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。
细胞库建立标准
细胞库建立概况一、对细胞库细胞基质总的要求(一)细胞系／株历史资料1.细胞系／株来源资料应具有细胞系／株来源的相关资料,如细胞系／株制备机构的名称,细胞系／株来源的种属、年龄、性别与健康状况的资料。
这些资料最好从细胞来源实验室获得,也可引用正式发表文献。
人源细胞系／株须具有细胞系／株的组织或器官来源、种族及地域来源、年龄、性别及生理状况的相关资料。
动物来源的细胞系／株须具有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官来源、地域来源、年龄、性别、病原体检测结果及供体的一般生理状况的相关资料。
2.细胞系／株培养历史的资料应具有细胞分离方法、细胞体外培养过程及建立细胞系／株过程的相关资料,包括所使用的物理、化学或生物学手段,就是否有外源添加序列,以及细胞生长特征、生长液成分、选择细胞所进行的任何遗传操作或选择方法等。
同时还应具有细胞鉴别、检定、内源及外源因子检测结果的相关资料。
应提供细胞培养液的详细成分。
如使用人或动物源成分,如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其她生物学活性的物质,应具有这些成分的来源、制备方法、质量控制、检测结果与质量保证的相关资料。
(二)细胞库的建立细胞库的建立可为生物制品的生产提供已标定好的、细胞质量相同的及能持续稳定传代的细胞种子。
1.原材料的选择建立细胞库的各种类型细胞的供体均应符合细胞库细胞的检定中相关规定。
神经系统来源的细胞不得用于生物制品生产。
培养细胞用牛血清应来源于无牛脑海绵体脑病流行地区的健康牛群,其质量标准应符合规定(附录XIII D)。
不得使用人血清作为细胞培养液。
如需使用人血白蛋白,则须使用有批准文号的合格制品。
消化细胞用胰蛋白酶应进行检测,证明其无细菌、真菌、支原体或病毒污染。
特别应检测胰蛋白酶来源的动物可能携带的病毒,如细小病毒等。
用于生物制品生产的培养物中不得使用青霉素或β- 内酰胺(β-Lactam)类抗生素。
2.细胞培养操作的要求细胞培养生产人员应定期检查身体。
在生产区内不得进行非生产制品用细胞或微生物的操作;在同一工作日进行细胞操作前,不得操作或接触有感染性的微生物或动物。
稳定细胞株的构建流程
稳定细胞株的构建流程以稳定细胞株的构建流程为标题，写一篇文章。
一、引言稳定细胞株的构建是生物学研究中常用的实验技术之一。
通过构建稳定细胞株，可以使目标基因在细胞中稳定表达，从而对其功能进行深入研究。
本文将介绍稳定细胞株的构建流程。
二、选择适当的宿主细胞稳定细胞株的构建首先需要选择适当的宿主细胞，常用的细胞包括人类胚胎肾细胞293细胞、小鼠骨髓细胞NIH3T3细胞等。
选择宿主细胞时需要考虑其易于转染、高细胞增殖率和细胞稳定性等因素。
三、构建载体1.选择适当的表达载体：常用的表达载体有质粒和病毒载体，根据实验需要选择合适的载体。
质粒载体便于操作和大规模扩增，而病毒载体能够高效地转染细胞。
2.插入目标基因：将目标基因插入表达载体中，可以通过PCR扩增得到目标基因片段，并使用限制酶切将其与表达载体连接。
连接后进行酶切鉴定和测序验证。
3.构建转染载体：将表达载体转化至适当的细菌宿主中，利用细菌的复制机制进行扩增。
扩增后提取纯化质粒。
四、转染宿主细胞1.选择合适的转染方法：常见的转染方法有化学法、电穿孔法和病毒转染法等。
根据宿主细胞的特性和实验要求选择最适合的转染方法。
2.优化转染条件：转染条件的优化对于获得高转染效率和稳定性的细胞株至关重要。
可以调整转染剂的浓度、时间和转染温度等因素。
3.筛选转染细胞：在转染后，使用适当的筛选压力，如抗生素选择、荧光标记等，筛选出转染成功的细胞。
五、稳定细胞株的筛选和鉴定1.单克隆细胞的筛选：通过稀释法将转染细胞稀释至单个细胞，然后培养形成单克隆细胞株。
2.目标基因表达的鉴定：通过Western blot、RT-qPCR等方法对目标基因的表达进行检测，确认稳定细胞株中目标基因的稳定表达。
3.稳定性的验证：长期培养稳定细胞株，观察目标基因的表达是否稳定，并进行细胞传代实验，验证细胞株的稳定性。
六、应用稳定细胞株稳定细胞株的构建完成后，可以用于进一步的实验研究，如基因功能研究、药物筛选和蛋白质表达等。
细胞系和细胞株
细胞系和细胞株细胞系和细胞株是细胞生物学中的两个重要概念。
细胞系是指一组同源或同种细胞，它们来自于同一个原始细胞并在体外不断传代，形成了一个稳定的细胞种群。
而细胞株则是指从一个细胞系中分离出的单个细胞，经过培养和传代后形成的单一细胞种群。
细胞系的建立是细胞生物学的重要研究方向之一。
早期的细胞系建立主要是通过原代培养，即将组织或细胞分离后在培养皿中进行培养，随着时间的推移，细胞会不断增殖并形成一定规模的细胞种群。
这种方法的缺点是细胞的生长状态不稳定，容易产生突变和异质性，难以保证细胞的同质性。
因此，现代的细胞系建立主要采用有限稀释法，即将细胞以一定的比例稀释后分配到多个培养皿中，每个培养皿中只有一个细胞。
经过多次传代后，每个培养皿中的细胞都来自于同一个细胞，形成了一个同质的细胞系。
细胞系的建立对于细胞生物学的研究至关重要。
首先，细胞系可以用于研究细胞的生长、分化、转化和凋亡等生物学过程，探究其机制和调控方式。
其次，细胞系可以用于研究人类疾病的发生和发展机制，例如癌症、心血管疾病等。
通过建立癌细胞系，可以研究癌细胞的生物学特性、药物敏感性和耐药性等，为癌症的治疗提供新的思路和方法。
细胞株是细胞系中的单个细胞。
它们在体外的培养条件下可以不断生长和增殖，形成一个稳定的细胞种群。
细胞株的建立通常是通过原代培养或单细胞克隆法。
原代培养是指将组织或细胞分离后在培养皿中进行培养，直到细胞生长到一定密度后，再将其分离成单个细胞，进行单细胞克隆。
单细胞克隆法是指将细胞分离成单个细胞，然后将每个细胞分别种植到培养皿中，等到细胞生长到一定密度后，挑选生长良好的细胞进行传代，最终形成一个同质的细胞株。
细胞株的建立对于细胞生物学的研究也具有重要意义。
首先，细胞株可以用于研究细胞的生长、分化、转化和凋亡等生物学过程，探究其机制和调控方式。
其次，细胞株可以用于研究药物的毒性和效果，对药物的筛选和评价具有重要意义。
此外，细胞株还可以用于生产生物制品，例如疫苗、抗体等，为生物医药产业的发展提供了重要的技术支持。
动物细胞培养技术
克隆环分离克隆图解
动物细胞的大规模离体培养技术
动物细胞的大规模培养是在生物反应器中高密度大量培 养有用的动物细胞以产生珍贵生物制品的技术。动物细胞的 大规模培养与实验室常规培养的主要区别，不仅表现在培养 规模的不同，而且还表现在所采用的培养的方式及培养工艺 的不同。 目前已开发出了一些各具特点的适用于动物细胞大规模 培养的技术和系统。 1、气升式培养系统 2、微载体培养系统 3、中空纤维培养系统 4、微囊培养系统
2、常规冷冻方法 动物细胞冻存和复苏的基本原则是慢冻快融。慢冻结冰在 细胞外形成，因此不致损害细胞。不同细胞的最适冻存速率、 冻存过程、冻存保护剂种类和用量等不同。目前广泛应用的是 二步冻结法，即先将细胞慢速冷冻至一定温度，如-30℃，使 细胞外冻结，胞内脱水，在液氮中长期储存。 复苏是以一定的复温速度将冻存的培养物恢复到常温的过 程。快速化冻可防止损害细胞，具体操作是将装有细胞的冻存 管从液氮中取出，立即投入37℃水浴中化冻，以避免再次结冰。 由于DMSO等保护剂在常温下对细胞有害，故在细胞复苏解冻后 要及时洗掉冷冻保护剂。 3、玻璃化冻存方法 玻璃化冻存法对动物细胞、皮膜和角膜等组织，尤其胚胎 等的保存也有良好的效果。下面以人单核细胞为例介绍动物细 胞的玻璃化冻存方法。 3.1、冻存过程 3.2、玻璃化冻存细胞的复苏
细胞系和细胞克隆
一、细胞株（系）的建立
由于细胞系和细胞株组成比较均一，生物性状比较清楚， 能传代培养已被广泛应用于生命科学研究和生物医药的生产。 常用的有Hela细胞系、Vero细胞系、BHK细胞系、CHO细胞系等。
二、细胞克隆技术 细胞克隆又称单细胞克隆或单细胞培养，即把单个细 胞从群体内分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群 体的技术。理论上，各种培养细胞都可用来进行克隆培养， 但实际上，能够进行克隆培养的细胞一般只是一些活力强、 增殖能力强以及对体外生长环境适应性强的细胞。原代培养 细胞和有限细胞系克隆培养比较困难，无限细胞系、转化的 细胞系和肿瘤细胞则比较容易。单细胞克隆技术有多种方法， 常用的有稀释铺板法、饲养层克隆法、胶原模板或血纤维蛋 白膜层板克隆法、琼脂克隆法等
细胞工程九个重要图解
组织工程应用前景展望
创伤修复与再生医学
疾病模型与药物筛选
利用组织工程技术，可构建出具有生物活 性的皮肤、人体组织，构建疾病模型，用于 研究疾病发生机制及药物筛选。
生物制造与器官移植
个性化医疗与精准治疗
借助3D打印等技术，实现复杂组织和器官 的体外制造，为器官移植提供新的来源。
VS
应用领域
细胞融合技术在生物医学研究中具有广泛 的应用价值。例如，可以用于制备单克隆 抗体、生产重组蛋白、研究细胞信号传导 和代谢途径等。此外，还可以应用于组织 工程和再生医学等领域，用于构建具有特 定功能的组织或器官。
04
染色体工程图解
染色体结构变异分析
01
02
03
04
缺失
染色体上某一区段及其带有的 基因一起丢失，从而引起变异 的现象。
融合后处理
在融合完成后，需要去除多余的融合剂，并对融合产物进行筛选和鉴定。常用的筛选方法包 括荧光激活细胞分选（FACS）和磁珠分选等。
融合产物鉴定及应用
鉴定方法
对融合产物进行形态学观察、免疫学检 测和遗传学分析等，以确认其身份和特 性。例如，可以使用显微镜观察细胞的 形态和结构；使用抗体检测特定蛋白的 表达；使用PCR或测序等方法分析细胞的 基因组。
05
基因转移技术图解
基因转移方法介绍
物理方法
包括显微注射、基因枪、电穿孔 等，通过物理手段将外源基因导
入受体细胞。
化学方法
利用化学物质如脂质体、磷酸钙 等，将外源基因与化学物质混合 后，通过细胞膜融合或吞噬作用
进入细胞。
生物方法
利用病毒载体或非病毒载体，如 逆转录病毒、腺病毒、慢病毒等， 将外源基因包装在病毒颗粒内， 通过病毒感染的方式将基因导入
优良细胞系的建立与筛选
• 2.小细胞团选育 • 即为在锥形瓶中对悬浮细胞集团进行培养。在培养期间使用目测筛选的方法对不符合条件的细胞
进行剔除。然后继续选育。例如黄酮苷细胞系的选育。
• 3.抗性选育 • 不同细胞对不同物质的抗性不同来进行筛选。一般用于选育某希望具有针对某种物质的抗性植株。 • 例如。薰衣草与长春花。
目测选育
青蒿
引例
• 青蒿素是一种医药用途广泛的植物提取物，今年的
中国本土诺贝尔生理奖获得者屠呦呦因发现青蒿素 在治疗疟疾上有很好效果而使它的作用进一步扩大。 但是青蒿素直接在植物中天然提取时，操作复杂， 产量低下。不过我们今天将要介绍的植物细胞工程 技术会解决这个问题，提高了生产青蒿素的效率， 让我们更加方便利用这一物质。
•
•
基本操作程序
• • • •
1.优良细胞系（细胞株）的建立与筛选 2.扩大培养 3.大型生物反应器的培养 4.次生代谢产物的提取：纯化与测定
•
1.建立筛选优良细胞系标准
优良细胞系的建立与筛选
•
• • • • • • • • • • • • • • • •
a,分散性好，适合大规模悬浮培养；b,均一性好，细胞大小、生理状态一致;
培养或连续培养等方法，生产代谢产物。
大型生物反应器 愈伤组织
第九章细胞系(株)的建立
2.细胞系的稳定性
细胞连续培养过程中主要指标有无明显变 异。使用稳定的细胞系能保证实验结果的准 确性、重复性。
3.细胞学特征
观察细胞系的形态和表达特征的数据及
其与来源细胞的差异。
4.微生物污染检查
有无病毒、细菌、真菌、支原体等污染。
大影响。
美 国 典 型 培 养 物 保 藏 中 心 （ Amercian
Type Culture Collection,ATCC ） 是 现 今 最
大的细胞库。
ATCC网址：/
ATCC接纳细胞必须检测的项目如下：
1.培养简历
2.培养液 3.冻存液 4.细胞活力 5.细胞形态类型
6.核型
7.无污染检验
8.物种检测
9.免疫检测 同时提供细胞系(株)建立者和检测者的 姓名。
中国国家专利局委托武汉大学建立的中 国典型培养物保藏中心（ China Center Type Culture Collection,CCTCC ） 保 藏 了 十 几 个
国家的专利培养物 1000 多株，非专利培养物
对
说明所使用的培养基血清，使用浓度、 并说明细胞生存的适宜温度、 CO2 浓度、 PH 值
等条件。有些细胞生长还需添加的一定附加
成分。
三、细胞系的鉴定
拟建立的细胞系或细胞株、除说明培养细 胞的来源外，还要对其进行一系列的鉴定。
1.检定细胞系的纯度
第九章 细胞系(株)的 建立与鉴定
一、基本概念
细胞系 细胞株
二、建立细胞系（株）的档案
建立细胞系或细胞株应对如下几方面加以说明：
1.培养细胞的来源 对拟建立的细胞系（株）应交代细胞供体所属物 种及供体的年龄、性别、取材的器官或组织。如是肿 瘤组织、应说明临床诊断结果、组织来源和病例号等。
细胞株和细胞系
Ｇ ｏｇ ｅ ｅｒｅ Ｇ ｙ把 其 建 立 的 人 体 宫 颈 癌 细 胞 Ｈ ｌ 称 为 ｅａ系
“ ” ９ ４年 ， ｉ 株 。１５ Ｗｈｔ 外 使 用 了“ ” 称 呼 Ａ．ａｒｌ ｅ另 系 来 Ｃｒ ｅ
培 养 的鸡 胚 心 脏 的 细 胞 群 ， 胞 系 （ｅ ｉｅ 由此 产 细 ｃｌｌ ） ｌ ｎ
２ 名词 使 用 的现 实 情 况
２ １ 中学 教 材定 义 ．
在 人教 版高 中生物 （ 修 ） 一册 选 全
生 ， 后 这 ２个 名 词 长 期 混用 。即使 在 １７ 之 ９ ９年 国际 组
织培养协会 专业术语 委员会颁 布 “ 业名词建 议” 专 和 １８ ９ ４年 在 宁 波 召 开 的 全 国 动 物 组 织 和 细 胞 培 养 会 议 Ａ Ｏ 型 数 据无 法 按 常 规 检验 平衡 。 Ｂ血 ３ Ａ Ｏ 血 型 相 关 算 法 的应 用 Ｂ
关 键 词 细 胞 株 细 胞 系
中国 图 书分 类 号 ： Ｑ２
１ 名 词 的 由 来
文 献 标 识码 ： Ｅ
通 过 “ 物 细 胞 、 织 和 器 官 培 养 技 术 的 一 些 术 语 的 动 组
译 名 和 解 释 ” 后 ， 目前 为 止 国 内 对 这 ２个 名 词 的 之 到
划 并 在 相 关 教 学 中 探 究 “ 讨 课 （ｅ ｎ ｒ） 规 律ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ， 研 ｓｍｉａｓ ” 对
上述 平 衡 群体 的频 率 做 预 期 频 率 去求 预 期 数 值 ． 进 再 行 ｘ检验 （ ： 请分 析 ： 时 的 ｄ＝ ） 此 ｆ ？ 另外 ， 常常 遇 到 求 出 的 ３个 频 率 加 和 ｐ ｑ ｒ １ ＋ ＋≠ 的 情 况 。此 时 可 求 出校 正 因 子 ０＝ 一 － — （ 论 上 １ｐ ｑ ｒ 理 ０＝ ）再 求 校 正 频率 ： ＝ ｒ ０／ ）１ ０／ ） ＝ １ ０， 矫 （＋ ２ （＋ ２， Ｐ矫 ｐ（ ＋ Ｏ／） ＝ １ Ｏ／） ２， ｑ ｑ（ ＋ ２ 。这 一 步 可 以重 复 ， 到 ０＝ ， 直 ０ 即 ｐ ｑ ｒ １ ［ ａ ｉ ．Ｈ ｒ Ｐ ｒｕ ｎｖｒｉ ） ‘ ｒ — ＋ ＋ ＝ 。 Ｄ ｎｅ Ｌ ａｔ ｕｄ ｅ Ｕ ｉｅｓ ｙ ， Ｐ ｉ ｌ ｌ（ ｔ ｎ
细胞库建立标准
细胞库建立概况一、对细胞库细胞基质总的要求(一)细胞系／株历史资料1．细胞系／株来源资料应具有细胞系／株来源的相关资料，如细胞系／株制备机构的名称，细胞系／株来源的种属、年龄、性别和健康状况的资料。
这些资料最好从细胞来源实验室获得，也可引用正式发表文献。
人源细胞系／株须具有细胞系／株的组织或器官来源、种族及地域来源、年龄、性别及生理状况的相关资料。
动物来源的细胞系／株须具有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官来源、地域来源、年龄、性别、病原体检测结果及供体的一般生理状况的相关资料。
2．细胞系／株培养历史的资料应具有细胞分离方法、细胞体外培养过程及建立细胞系／株过程的相关资料，包括所使用的物理、化学或生物学手段，是否有外源添加序列，以及细胞生长特征、生长液成分、选择细胞所进行的任何遗传操作或选择方法等。
同时还应具有细胞鉴别、检定、内源及外源因子检测结果的相关资料。
应提供细胞培养液的详细成分。
如使用人或动物源成分，如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其他生物学活性的物质，应具有这些成分的来源、制备方法、质量控制、检测结果和质量保证的相关资料。
(二)细胞库的建立细胞库的建立可为生物制品的生产提供已标定好的、细胞质量相同的及能持续稳定传代的细胞种子。
1．原材料的选择建立细胞库的各种类型细胞的供体均应符合细胞库细胞的检定中相关规定。
神经系统来源的细胞不得用于生物制品生产。
培养细胞用牛血清应来源于无牛脑海绵体脑病流行地区的健康牛群，其质量标准应符合规定(附录XIII D)。
不得使用人血清作为细胞培养液。
如需使用人血白蛋白，则须使用有批准文号的合格制品。
消化细胞用胰蛋白酶应进行检测，证明其无细菌、真菌、支原体或病毒污染。
特别应检测胰蛋白酶来源的动物可能携带的病毒，如细小病毒等。
用于生物制品生产的培养物中不得使用青霉素或β- 内酰胺(β-Lactam)类抗生素。
2．细胞培养操作的要求细胞培养生产人员应定期检查身体。
在生产区内不得进行非生产制品用细胞或微生物的操作；在同一工作日进行细胞操作前，不得操作或接触有感染性的微生物或动物。
建立细胞系或细胞株
建立细胞系或细胞株各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定的和生物性状清楚的细胞群。
因此凡符合上述情况的细胞群也可给以相应的名称，即文献中常称之为已鉴定的细胞（Certified Cells）。
已鉴定的细胞可用于各种实验研究和生产生物制品。
当前世界上已建的各种细胞系（株）已难胜数，我国也建有百种以上，并在不断增长中。
一、体外培养细胞的种类和命名体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。
最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。
我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考Schaeffer，W.I.（1979）和国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。
（一）初代培养初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。
一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。
（二）细胞系初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。
如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。
无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。
无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。
这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。
为概念上的明确，本书中对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一词表示可能更妥。
而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。
人喉癌细胞系的建系研究进展
人喉癌细胞系的建系研究进展汤玮晶;陶磊【摘要】细胞系的建立可以详细分析肿瘤细胞的生物学、形态学、抗原性和细胞原性的特征.喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,病理分型以鳞状细胞癌为主.本文就细胞培养、细胞系和细胞株的建立和保存,肿瘤细胞的体外培养、人喉癌细胞系的建系情况、建系方法、细胞系的主要特性和细胞系培养过程中存在的问题进行综述.【期刊名称】《中国眼耳鼻喉科杂志》【年(卷),期】2014(014)006【总页数】3页(P405-407)【作者】汤玮晶;陶磊【作者单位】复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科上海200031;复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科上海200031【正文语种】中文1.1 细胞培养细胞培养技术的核心是使细胞在离体条件下能够正常生长代谢、分化增殖并维持其结构和功能[1]。
迄今为止，已经建立的连续和有限的细胞系和细胞株已有5 000种以上，包括各种组织细胞、转化株、突变株、杂交细胞株等。
细胞培养技术已经成为研究细胞生物学、免疫学、遗传学、病毒学、神经生物学甚至临床医学等各种基础理论研究以及基因工程和细胞工程等生物工程产业的最重要支持技术之一[2]。
美国动物学家Ross Granville Harrison于1907年首次成功地在体外培养基(凝结的淋巴液)中培养了神经元，被称为“组织培养之父”。
进入20世纪50年代后，细胞培养技术得到快速发展。
如今，细胞培养已成为全世界有关生命科学与医学实验广为应用的技术之一[3]。
1.2 细胞系和细胞株[4] 将从有机体得到的细胞在体外进行第1次培养，称之为原代培养，也叫初代培养。
如果对原代培养物进行传代培养，此时的培养物就称为细胞系。
通过选择或克隆化培养，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊遗传、生化性质或特异标记的细胞群称为细胞株。
在实际运用中，细胞系和细胞株的概念常常被相互混淆。
1.3 细胞系(株)的保存[5] 已经建立的细胞系(株)由作者自行管理不便于使用交流，同时还存在细胞易污染和丢失等弊病。
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、概念、概念
1、细胞系（Cell Line）：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。
2、细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。
细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。
如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecell strain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuous cell strain）。
对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。
二、建立细胞系（或株）的要求
什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。
对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做如下说明：
1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；
个体性别、年龄；取材的器官或组织。
如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。
2、细胞生物学检测：
了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。
如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。
3、培养条件和方法；应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。
三、若干细胞建株的要点及基本过程
（一）肿瘤细胞培养技术要点
1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。
取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。
其培养方法及冻存方法同前述正常组织。
2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。
排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。
3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率
根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。
一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。
如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。
用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。
也可以考虑动物媒介培养。
（二）人类淋巴母细胞建株方法
l、4ml肝素抗凝血于离心管中，加入2ml RPMI 1640。
2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有4ml淋巴细胞分离液的液面上静置30min。
3、1500rpm，15min，吸取白细胞层（第二层）于另一离心管中。
4、加RPMI 1640 5ml洗涤白细胞两次。
5、将白细胞接种至1ml RPMI 1640培养基中，加入10μl环胞霉素和100μl的EBV（EB病毒）液，混匀。
6、水浴摇床，40次/分，37℃，3hr。
7、1500rpm，15min。
将细胞接种至1ml培养基中（内含谷氨酰胺1mM／ml）加入10μl环胞霉素，轻轻混匀，37℃培养。
8、5天后观察细胞转化和生长情况，决定是否半量换液。
一般半量换液l—2次，并维持环胞霉素的浓度。
9、待转化细胞数量明显上升，并出现细胞团块后，可转入25ml细胞培养瓶中，加1—2ml培养基，37℃培养10—15天，一般每隔3—4天观察一次，决定是否换液，传代。
10、细胞生长达一定数量后冻存，冻存前应进行核型分析和存档。
1、细胞系（Cell Line）：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。
2、细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。
细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。
如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecell strain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuous cell strain）。
对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。
二、建立细胞系（或株）的要求
什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。
对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做如下说明：
1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；
个体性别、年龄；取材的器官或组织。
如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。
2、细胞生物学检测：
了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。
如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。
3、培养条件和方法；应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。
三、若干细胞建株的要点及基本过程
（一）肿瘤细胞培养技术要点
1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。
取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。
其培养方法及冻存方法同前述正常组织。
2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。
排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。
3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率
根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。
一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。
如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。
用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。
也可以考虑动物媒介培养。
（二）人类淋巴母细胞建株方法
l、4ml肝素抗凝血于离心管中，加入2ml RPMI 1640。
2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有4ml淋巴细胞分离液的液面上静置30min。
3、1500rpm，15min，吸取白细胞层（第二层）于另一离心管中。
4、加RPMI 1640 5ml洗涤白细胞两次。
5、将白细胞接种至1ml RPMI 1640培养基中，加入10μl环胞霉素和100μl的EBV（EB病毒）液，混匀。
6、水浴摇床，40次/分，37℃，3hr。
7、1500rpm，15min。
将细胞接种至1ml培养基中（内含谷氨酰胺1mM／ml）加入10μl环胞霉素，轻轻
混匀，37℃培养。
8、5天后观察细胞转化和生长情况，决定是否半量换液。
一般半量换液l—2次，并维持环胞霉素的浓度。
9、待转化细胞数量明显上升，并出现细胞团块后，可转入25ml细胞培养瓶中，加1—2ml培养基，37℃培养10—15天，一般每隔3—4天观察一次，决定是否换液，传代。
10、细胞生长达一定数量后冻存，冻存前应进行核型分析和存档。