荧光光谱的原理和应用

Stocks shift
发射光谱的形状 与激发波长无关
荧光的光谱特性
荧光特 性参数
稳态
瞬态
波长和 强度
偏振性 能
量子产 率
荧光寿 命
磷光
磷光寿 命
磷光光 谱
波长和强度
基本概念
激发波长：固定荧光的发射波长而不断改变激发光的波
长，并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对激发波 长的谱图称为荧光的激发光谱。
应用：
荧光寿命与物质所处微环境的极性、粘度等条件有关，因 此可以通过荧光寿命直接了解所研究体系发生的变化。
荧光寿命的计算

荧光测试技术
同步荧光测定；导数荧光测定；三维荧光光谱技术 时间分辨荧光测定；相分辨荧光测定； 荧光偏振测定；荧光免疫测定； 低温荧光测定； 固体表面荧光测定； 近红外荧光分析法； 荧光反应速率法 荧光显微与成像技术；空间分辨荧光技术荧光探针技术；
郑永丽 上海交通大学化学化工学院
20131115
主要内容
概述 荧光光谱法原理 荧光的光谱特性 我们有关荧光的工作
概述
基本概念
能级: 现代量子物理学认为原子的可能状态是不连续的， 因此各状态对应能量也是不连续的。这些能量值就是能级
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级 回到基态所发出的辐射。
测试方法：
①参比法 Yu=YS·(Fu/Fs)·(As/Au ) ·(nu/ns)(A<0.05)；②直接测 量法，要求仪器有积分球
注意事项：
温度，溶剂，激发波长，浓度
应用：
量子产率取决于辐射和非辐射跃迁过程，即荧光发射、系 间跨越、外转移和内转移等的相对速率
常用物质的量子产率
Q.Y. Standards
荧光分析法的特点
灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1-3个数量级； 选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸
收的分子不一定发射荧光或磷光； 试样用量少和方法简便 能提供比吸收光谱多的物理参数 应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发
荧光。
荧光光谱法原理
荧光和磷光的产生
吸收光谱与发射 光谱镜像关系
单分子荧光检测技术； 荧光光纤化学传感器
常用荧光探针
探针 1,8-ANS
Ex(nm) Em(nm)
372
480
探针 Cy3
Ex(nm) Em(nm)
550
570
Hydroxycoumarin 325
386
Hoechst 33342
343
483
Aminocoumarin
350
445 Ethidium Bromide 493
发射波长：固定激发光的波长而不断改变荧光的测定波
长并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对发射波长 的谱图则为荧光的发射波长。750000
Ex 463 nm
Em 530 nm
500000
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱIntensity
图 荧光染料C-540A 的激发和发射光谱
250000
0
400
500
600
700
Wavelength / nm
基本概念
测试方法：
1)判断激发波长：①根据分子结构判断；②参照吸收光谱； ③三维扫描
2)以判断的波长为激发，做发射扫描，可以得到发射波长 3)利用得到的发射波长，进行激发扫描，即可得到激发波长
强度：
比尔-朗伯定律 If=2.303YfI0εb c
应用：定性和定量
荧光波长和强度与结构的关系
①跃迁类型（pi->pi*荧光比较强，即有双键的物质荧光强） ②共轭效应（共轭体系是pi电子更容易被激发，荧光强） ③刚性平面结构（有这种结构的分子可以减小分子的振动，碰撞失活
可能性小，荧光强） ④取代基效应（给电子基团，荧光增强；吸电子基团，荧光减弱甚至
猝灭）
荧光强度与环境因素的关系
• ①溶剂极性可增加 或降低荧光强度； ②与溶剂作用从而 改变荧光物质结构 来增加或降低荧光 强度。
溶剂
温度
• 温度升高，荧光强 度下降(因为内、 外转换增加、粘度 或“刚性”降低)。
•具酸或碱性基团的 有机物，在不同 pH 值时，其结构可能发 生变化，因而荧光强 度将发生改变
pH值
内滤光 和自吸
•体系内存在可以吸收荧光 的物质，或荧光物质的荧 光短波长与激发光长波长 有重叠，称为内滤光；荧 光物质浓度较大，吸收自 身的荧光发射，称为荧光 自吸。
Elizabeth A J et l., FRET Imaging. Nature Biotechnology, 2003,21:13887-1395 Rajesh B S. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of
live cell protein localizations. J Cell Biology, 2003, 160: 629–633 Jin Zhang, et al.,. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal
BFP-GFP BFP-YFP CFP-YFP CFP-dsRED GFP-dsRED
荧光寿命
基本概念
定义：当激发光切断后荧光强度衰减至原强度的1/e所经
历的时间。它表示了荧光分子的S1激发态的平均寿命。
测试方法：
①时间相关单光子记数法(Time-Correlated Single-Photon Counting , TCSPC); ② 相调制法(Phase Modulation Methods) ③频闪技术(Strobe Techniques).
发光聚合物荧光性能的测定
参考书目
Jonathan D. Violin,et al., A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase C. J Cell Biology, 2003,161:899–909
[nm]
4
PBS
540
27
PBS
620
53
Methol
580
95
0.1M NaOH, 220C
496
97
Cyclohexane
300
58
0.1 M H2SO4, 220C
350
100
Ethanol
450
95
Water
488
31
Water
514
13
Water, 200C
280
14
Water
270
荧光偏振
基本概念
定义： 测量：
①L-型或者单通道法 ②T-型多通道法
应用：
流动性,分子基本性质,酶学 分子相互作用,荧光偏振免疫,成像
常用偏振研究的荧光分子：
1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)；罗丹明B；2-苯胺基-6-萘 磺酸钠(2,6-ANS)
荧光共振能量转移(FRET)
FRET需要条件
供体分子的发射光谱和受体分子的 吸收光谱必须有显著的重迭，一般 大于 30％；
供体分子和受体分子间的距离必须 在 1-10 nm 之间.D和A间的FRET 效 率：
R0: E=50%时供体和受体分子间的 距离 对于特定的供体受体对是常数; R: 供体和受体分子间的距离. E: FRET效率. 对于R特别灵敏
磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出 的辐射。
分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )：又 称为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强 度与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光 光谱的形状和荧光峰对应的波长进行的定性分析．
基本概念
定义：
当一个荧光分子（又称为供体分子，Donor）的荧光光谱 与另一个荧光分子（又称为受体分子，Acceptor） 的激发 光谱相重叠时， 供体荧光分子的激发能诱发受体分子发 出荧光， 同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。
FRET现象的特征:
选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光
Cy3 Cy5 Cresyl Violet Fluorescein popop Quinine sulfate Rhodamine 101 Rhodamine 6G Rhodamine B Tryptophan L-Tyrosine
Q.Y.
Conditions for
Excitation
[%]
Measurement
荧光寿命模块
图 荧光分光光度计的光学系统
两亲性超支化聚合物分子自组装
HBPO-star-PEO
荧光光谱法研究内容
聚合物CMC的测定 荧光猝灭法测量分子的分布 能量共振转移制备荧光呼吸囊泡 荧光偏振测量分子的流动性 荧光寿命研究体系微环境 发光聚合物荧光性能的测定
聚合物CMC的测定
visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Current Biology 2000, 10:1395–1398
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母爱
母爱是伞，为你遮风挡雨。 母爱是衣，为你送去温暖。 母爱是灯，为你送去光明。 母爱是光，照亮你的心灵。 在寒冷的年代里，母爱是温暖。 在温暖的年代里，母爱是关怀。 在文明的年代里，母爱是道德。 在欢乐的年代里，母爱是幸福。
1
400
3
Intensity
200
芘不溶于水，溶于 乙醇、乙醚、甲苯、 四氢呋喃等有机溶 剂。随着溶剂的极 性增加，I1/I3降低， 因而可以用于聚合 物组装的研究
0
360
380
400
420
440
460
480
Wavelength / nm
Journal of Polymer Science, Part A: Polymer Chemistry 48 (20) , pp. 4428-4438
能量共振转移制备荧光呼吸囊泡
B) Schematic representation of the protonation and deprotonation of PEG-b-PDMA-Azo in the C) Steadystate fluorescence spectra of the vesicular solution at pH values between 4 and 12 D) Reversible pHinduced change in the fluorescence upon the alternate addition of HCl and NaOH
供体分子的发射态偶极矩与受体分 子的吸收态偶极矩、以及它们的向 量必须满足一定的条件
应用
检测两个发光分子间的重合与共定位 检测分子间的相互作用 检测分子的折叠与构象变化
供体-受体荧光分子对
染料类(Dye)
FITC-Rhodamine Alexa488-Cy3 Cy3-Cy5
绿色荧光蛋白类(Green Fluorescent Proteins, GFPs)
impact of substrate tethering. PNAS ,2001, 98: 14997–15002 Michael G. Erickson, et al., DsRed as a Potential FRET Partner with CFP and GFP.
Biophysical Journal , 2003,85:599–611 Alexander Sorkin, et al., Interaction of EGF receptor and Grb2 in living cells
有序介质的影响(表面活性剂)
CMC
Intensity
1500000
1000000
500000
0 350
0.0001 0.0005 0.001 0.005 0.01 0.05 0.1 0.5 1 mg/ml
400
450
Wavelength (nm)
荧光量子产率
基本概念
定义：
荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光 的光子数之比值.(Y)
620
NBD
466
536 Fluo-3 (膜穿透性) 506
526
Fluorescein
495
519
DPH
362
432
Rhodamine B
570
590
EGFP
488
507
Alexa Fluro 350
343
442
Calcein
496
517
我们有关荧光的工作
荧光稳态模块
系统总图
显微荧光模块
磷 光 模 块