环境雌激素及其检测技术

【关键词】环境雌激素
环境雌激素类(Environmental estrogens,EEs)内分泌干扰物是指一类具有雌激素样作用的化合物，能模拟或干扰天然激素的生理、生化作用，对生物体产生各种毒效应，包括干扰体内正常内分泌物质的合成、释放、运输、结合、代谢等过程，激活或抑制内分泌系统的调控功能，出现生殖器官异常，雄性雌性化等〔１〕。

目前，EEs分布广泛，种类繁多，并且随着工业化的进程，EEs的污染有进一步扩大的趋势，不仅成为人类健康的潜在威胁因素，也威胁到生物种族的存亡。

各国政府、WHO等组织高度重视，美国国家资源委员会将其列为5个最优先项目之一。

因此，必须建立一套快速简便、科学灵敏的EEs检测筛检方法，并结合其对人体的作用机制，从而对EEs作出科学的、综合的评价，以保护人类健康，预防对人类的危害。

1 EEs及作用机制
EEs种类繁多，结构差异较大，对雌激素的干扰作用也有多种不同途径〔２〕。

目前已报道的EEs主要有以下几类：(1)植物雌激素；(2)人工合成药用雌激素；(3)烷基酚类；(4)杀虫剂类；(5)邻苯二四甲酸酯类；(6)多氯联苯与二 英类；(7)金属及非金属类。

研究表明，大多数EEs对机体雌激素、雄激素、甲状腺激素等产生明显的干扰作用，临床上表现为畸胎、生长发育异常、生殖功能障碍、代谢紊乱甚至癌症等；野生动物调查也显示，EEs可引起贝类、鱼、鸟和哺乳动物生育能力下降，引起雄性化、雌性化或双性化，也可使子代存活率下降而可能使某些物种灭绝。

但植物雌激素在一定剂量下对人类健康有利，保护人类免患激素依赖性疾病(如乳腺癌)和某些心血管疾病。

目前，虽然在内分泌及生殖系统的生物学效应具体机制还不十分明确，但主要具备以下4方面的能力；(1)模仿内源性激素；(2)拮抗内源性激素；(3)破坏内源性激素的生成和代谢；(4)破坏激素受体的生成与代谢。

同时，EEs 也能与雌激素受体结合，形成配体-受体复合物，结合到DNA的激素反应元件上，从基因水平调控生理生化过程。

此外，EEs还可能改变基因组的稳定性，可引起细胞数量、结构、功能改变，并影响细胞周期动力学，主要包括DNA损伤、端粒融合、染色体畸形等。

2 检测鉴定方法
目前对EEs的检测主要是对环境化合物雌激素活性的评价，以期探索环境雌激素对人类及野生动物的影响。

检测方法种类繁多，包括化学测定法、生物学方法、细胞学方法和分子生物学方法。

由于需同时考虑EEs化学物降解和体内的代谢情况以及与雌激素受体作用的能力的不同，因此，各种检测方法的适用范围不同，敏感性也不同。

2.1 化学测定法
EEs的化学测定方法文献报道主要包括：气相色谱法〔３〕、高效液相色谱法〔４〕、气相色谱-质谱联用法〔5〕和液相色谱-质谱联用法〔6〕等。

其中，尤以气相色谱法和液相色谱法应用较多。

近年来，将高效液相色谱法与其他各种检测技术相结合用于检测EEs日益增多，检测水平得到提高。

2.1.1 高效液相色谱法(HPLC)〔７〕
单纯应用HPLC同时定性、定量测定水中双酚A(BPA)和4-壬基酚(4-NP)，检出限为0.1～1.0 mg/L，被测组分的加标回收率为95.3%～106.6%。

特点是具有灵敏度高、准确度高、简便、快速，可同时检测BPA和4-NP2种EEs。

此外，应用柱前荧光衍生和HPLC 相结合定量检测尿和血清中的EEs，检出限为2.7～8.3 μg/L；加标回收率尿样为78.0%～102.5%，血清样品72.6%～98.6%；方法精密度为1.29%～4.52%。

此外，利用荧光试剂对硝基苯甲酰氯(p-nitrobenzoyl chloride)做衍生剂，与上述被测化合物结合后用HPLC进行分离测定。

本法具有衍生反应可于室温下进行，反应速度快，方法简便快捷，灵敏准确和操作步骤简单等特点，适用于尿样和血清样品中雌激素的测定。

2.1.2 固相微萃取技术结合高效液相色谱法〔8〕
固相微萃取技术(Solid Phase Micro Extraction，SPME)是20世纪90年代初发展的样品预处理技术，基本原理是基于待测物在样品及萃取涂层之间的分配平衡，通过对样品的富集，提高检测灵敏度。

Wen〔8〕利用SPME结合HPLC技术检测水中EEs含量，具有灵敏度高，重复性好的特点。

2.1.3 高效液相色谱法-飞行时间质谱法(HPLC ToF)〔9〕
该方法是将HPLC与飞行时间质谱技术(TOF MS)相结合，用于测定物质的相对分子量，尤其适用于混合物中各组分的分子量测定。

由于该方法可以在一次测定中，既得到杂质的个数，也能获得杂质的分子量信息，所以是纯度鉴定的有效方法。

缺点是存在一定的误差，其分辨率不如电喷雾电离离子化-质谱(ESI MS)法。

尤其是当杂质的分子量相近时，不能确定杂质的存在。

应用该方法检测河泥中的EEs时，检测限为0.03～0.04mg/g。

此外，Farre M〔10〕等应用HPLC结合串联质谱技术(MS/MS)，建立高效液相色谱-串联质谱联用法(HPLC MS/MS)用于检测水中的EEs，检测限为0.05?mg/L。

由此可见，虽然应用化学测定法检测EEs技术种类繁多，但是这些方法检测的样品均以水样为主，并且样品前处理程序复杂，因此限制了它的应用。

2.2 整体动物试验
2.2.1 子宫生长试验(uterus growth test)〔11〕
子宫生长试验是最早建立的检测EEs活性的经典方法。

子宫含有丰富的雌激素受体(Estrogen Receptors,ER)，当外来化合物与ER结合后，可使子宫的雌激素诱导蛋白(Induce Proteins,IPs)含量增加，刺激子宫生长，通过测定动物子宫重量或计算其脏器系数，可评价受试物的雌激素活性及强度。

这是最早建立的检测雌激素活性的方法，尽管灵敏度不高，影响因素较多，目前仍广泛应用。

2.2.2 过氧化物酶活力测定〔12〕
由于雌激素或具有雌激素活性的化合物作用于子宫时，可引起子宫产生大量糖原、磷酸酯酶和过氧化物酶等，而只有过氧化物酶对雌激素作用为特异性应答，其活力和含量可反映化合物的雌激素活性和强度，因此该试验即根据酶的活力判断受试物的雌激素活性。

由于过氧化物酶在常温下易失活，且酶活性会随时间的延长而下降，因此试验操作须在低温条件下即时测定。

此外，子宫血管渗透性试验〔13〕在整体动物试验中也曾用于检测EEs，该方法根据子宫血管对受试物的渗透性的大小与物质雌激素活性呈正相关的特点，以小鼠子宫组织的放射性与血浆的放射性之比来表示EEs的含量。

2.3 细胞培养试验
2.3.1 人类乳腺癌细胞培养
MCF 7是一种ER阳性的人类乳腺癌细胞，常被用于ER的研究，称之为E SCREEN 试验〔14〕。

该细胞ER受外界物质刺激后，可诱发细胞内反应，分泌一种53KD的外蛋白(exoprotein)。

该蛋白的分泌受雌激素特异性调控，因此，外蛋白的产生及其含量可用于判断受试物是否具有雌激素活性及其活性强度。

另外，T47D作为另一种ER阳性的人类乳腺癌细胞，也常被用于ER的研究〔15〕。

2.3.2 肝细胞卵黄素生成试验〔16〕
卵黄素(VTG)是由卵生脊椎动物肝细胞合成的一种大分子蛋白质，分泌入血后被卵细胞通过受体介导的胞吞作用摄入，作为卵黄蛋白储存于卵细胞中，为胚胎的发育提供能量。

在卵生脊椎动物中，VTG的合成依赖雌激素对肝细胞的诱导和刺激。

它通常发生在雌性动物，但在雄性动物中，雌激素也能诱导肝细胞合成VTG。

根据这一特性，检测雄性卵生脊椎动物肝细胞合成的VTG可作为评价EEs的一个生物标志物(biomarker)。

除了VTG外，还有一类生物标记即卵黄包被蛋白(VEPs)，它的检测原理与作用与VTG 相似，也是在正常情况下只在雄性动物体内合成该物质，但当雄性动物暴露在雌激素下，体内可产生VEPs，只是由于VEPs是一类极端疏水的蛋白，因此应用常规技术较难测定，故较少应用〔17〕。

2.3.3 大鼠子宫腺癌细胞培养〔18〕
子宫腺癌细胞是一种来源于RUCA-1型大鼠子宫的肿瘤细胞模型，含有丰富的ER，体外培养时仍可保持对雌激素的应答。

雌激素或具有雌激素活性的物质可与细胞ER结合，诱导雌激素特异蛋白补体3(C3)的合成。

因此培养液中C3的含量可作为受试物是否具有雌激素活性及其活性强度的判断指标。

此外，2005年由美国Xenobiotic Detection systems公司研制的E CALUX检测系统，则是应用人子宫癌细胞(BGI)转染带有雌激素效应的荧光素受体基因质粒进行EEs的筛检工作，也取得了良好的效果〔19〕。

2.4 受体竞争结合试验〔20〕
受体竞争性测定是从受体水平直接判断某化合物的雌激素样作用。

子宫或某些ER细胞的胞质和胞核中均含有大量的ER，EEs可与雌激素竞争ER，导致与ER结合的雌激素下降。

用放射性物质标记雌激素，与待测物共同孵，测定受体复合物的放射活性可推算出待测物与ER的结合常数，据此可评价该物质雌激素活性的强弱。

缺点是该方法不能从基因水平说明EEs对机体的影响。

2.5 分子生物学方法
2.5.1 重组酵母测评试验〔21〕
重组酵母系统(Recmbinant yeast estrogen system)是近年来建立的一种环境雌激素的快速筛检方法。

其原理是将全长人雌激素受体酵母表达载体pGAD hER和雌激素反应元件(Estrogen Response Elements,ERE)调控的酵母报告载体pLacZi 2ERE导入酵母细胞中，构建重组酵母YM ADER ERE。

如果受试物具有雌激素样作用，则可与雌激毒害受体形
成复合物，促进重组酵母报告基因LacZ表达，产生β 半乳糖苷酶(β galactosidase)，故通过测定β 半乳糖苷酶的活性即可反映受试物的雌激素样作用。

该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、快速以及费用低廉等优点，应用前景十分广泛。

国内近2年才开展对该方法的应用。

缺点是由于该方法建立不久，正处于发展和完善阶段，有必要对实验方法进行优化，同时由于对实验室设备要求较高也限制了该方法的开展应用。

2.5.2 非同位素印记/RNase保护试验〔22〕
非同位素印记/RNase保护试验(RNase protection assay)就是一种利用非放射性同位
素标记的RNA探针对基因表达产物RNA进行定性定量分析的有效方法。

向待测RNA溶加入过量的反义RNA探针，互补的部分形成RNA：RNA杂交分子，经RNase选择性水解去除未形成RNA：RNA杂交双链的单链使成单核苷酸。

测定未被RNase水解的RNA探针的长度及含量，即可对待测RNA进行定量和定性分析。

RNase保护试验灵敏度极高，可以检测出ng水平的EEs。

除上述分子生物学检测技术外，Granek V〔23〕等应用电阻抗装置测定、Eguchi K〔24〕等应用酵母two hybrid(二杂化物)检测、Bloger〔25〕等应用荧光偏振试验、Yasui M〔26〕等应用配体结构域重组酵母试验以及应用LeC 9转染细胞系统检测EEs均取得较好的灵敏度和特异性。

2000年，美国国家环境保护局(EPA)内分泌干扰物筛检和测试顾问委员会(EDSTAC)推荐了2级筛选方案〔27〕。

第一级筛选方案包括3个体外试验和5个体内试验。

体外试验包括雌激素受体结合或转录活化试验、雄激素受体结合或转录活化试验和睾刃甾体产生试验。

5个体内筛选试验为啮具类3d子宫增重试验、啮齿类20 d雌性青春期甲状腺试验、雄性啮齿类５～７d Hershberger试验、青蛙甲状腺功能变态试验和鱼类性复发试验。

第二级测试方案主要有哺乳类两代繁殖毒性试验。

此外，Houtman CJ〔28〕等研制应用雌激素亚型 化学活性荧光素酶基因表达生物测定法进行筛检，称为ER CALUX(chemical activated luciferase gene expression)。

近10年来，环境雌激素样作用一直是研究的热点，由于EEs种类多，作用机制复杂，目前对其分子机制了解还不透彻，但是建立一套完善的筛选、检测程序，并对其加以综合评价，应是控制危害的基础。

3 小结
EEs污染问题早已引起欧美、日本等发达国家高度重视，并开展了大量污染与防治研究工作。

我国在2001年正式启动环境激素样物质污染、毒效应与机制方面的大规模研究，起步相对较晚，基础研究、科普宣传很不够。

目前，我国对EEs污染的定量研究报道较少，在EEs作用于生物体内分泌系统的分子生物学机制等关键性基础研究上与发达国家存在较大差距，这些都有待于深入研究。

当前，应建立科学、灵敏、简单、经济、成熟、标准化的检测方法，建立监测系统，并且结合EEs对人体的作用机制提出合理的预防措施，尽可能的减少其对人体的危害。

同时，环保、医疗、卫生部门应共同努力，最大程度减少EEs的污染，改善生存环境，保护人类健康。

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