国家自然科学基金申请技巧讲座

综上所述，分子生物学技术的发展为研究白 内障发生过程中的功能基因及特异调控基因提供 了有利武器。本项目从晶状体上皮细胞入手，利 用改良的消减杂交技术和基因芯片技术系统研究 与白内障相关的基因，并采用对体外培养细胞和 在体晶状体上皮细胞的基因转染，探讨它们在晶 状体上皮细胞变化和白内障形成中的作用，可望 阐明白内障晶状体上皮细胞变化的分子生物学机 制，为防治白内障提供新的思路和理论依据。
由于目前尚没有针对白内障研究的现成基因芯 片，根据本研究的需要，我们将筛选到的差异表达 的所有基因建立cDNA文库，再利用基因芯片技术 制备成基因芯片，以此检测多个样本中白内障晶状 体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基 因，从中进一步筛选出白内障特异的基因，它们中 可能有已知基因，也可能有未知基因。通过以上两 种技术的有机结合，我们能更快捷、有效、准确地 得到白内障相关基因。
采用改良的消减杂交技术建立老年性白内障 晶状体上皮细胞差异表达基因文库并制备基因芯 片，利用此芯片筛选出白内障相关基因。通过基 因转染在体和培养的晶状体上皮细胞，观察细胞 的形态、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶状体蛋白的 变化，研究基因的功能。从晶状体上皮细胞的角 度阐明老年性白内障发生的分子生物学机制，为 防治白内障提供新思路和理论依据。
再次对二审会确定资助项目进行审查： 进一步查重； 以往承担项目是否按期完成； 是否有违反基金委有关申请规定。 基金委员会委务会审议。 下发批准、未批准通知。
第二部分
如何撰写国家自然科学基金 申请书
一、摘 要（限400字）
包括：研究方法、内容、目标、科学意义等
如：“用……方法（手段）进行……研究，探索/ 证明……问题，对阐明……机制／ 揭示……规律有重要 意义，为……奠定基础／提供……思路 ”
4、对拟采用的技术方法进行介绍和分析。 成熟的方法要简要介绍，重点阐明可以应用于本研 究 的依据。 新方法要详细介绍其原理，并阐明可以应用于本研 究 的理论依据和实验依据。 要特别注意的问题：必须对项目中所运用的技术方 法 的原理、流程及在实际应用中可能出现的问题要十分清 楚，绝不能是一种简单的移植。 例如：单链抗体+功能基团，理论上可以实现融 合，
注意事项
注意逻辑性和层次感，并随时点题。 文字表达要精雕细琢，避免假大空。 参考文献必须提供作者全名、出处。 参考文献必须引用02年甚至03年的文献。
防治白内障必须针对其发病的主要环节。多 年以来，国内外学者从不同的角度探讨白内障的 发生机理。就致病的环境因素讲，氧化因子、紫 外线辐射、晶状体周围环境中离子浓度改变及一 些生长因子、细胞因子的改变均与老年性白内障 的发生有关。就研究的部位分，晶状体中皮质与 核的蛋白质改变及晶状体纤维的改变与白内障的 形成有关，而位于晶状体前囊膜下单层的晶状体 上皮细胞在白内障的形成中的变化更引人关注。
体外实验也证实多种因素(H2O2、UV-B、晶 状体蛋白的自身抗体)诱发的白内障模型中晶状体 上皮的损伤是晶状体混浊的主要环节[6-8]。因此， 从晶状体上皮细胞的变化入手探讨白内障的成因， 有可能抓住揭示白内障发病机理的主要环节。而晶 状体上皮细胞变化的基因调控机制是问题的关键所 在，也是有待我们深入研究的问题。
基因芯片技术的出现，使检测差异表达基因和 未知DNA分子变得更快捷、准确、高效。基因芯片是在 1996年被提出并开始研制的，该技术是将成千上万的 DNA探针集中到1厘米见方的基片上，利用碱基互补原 理，DNA探针中的已知碱基序列与被测定的未知DNA分子 杂交后由标记分子标记杂交体，经自动阅读设备分析杂 交结果，从而对检测基因进行定性、定量和结构分析， 确定未知DNA分子。
2、国内外现状分析（综述）
存在问题： 文献复习不够，对国内外现状缺乏真正了解， 提出的问题别人已解决---低水平重复。
(
对研究方法不熟悉，简单移植或夸大其作用， ---已有方法与掌握方法的人的结合； ---方法理论上可行与现实可行性的结合。 对国内外现状只是简单罗列，缺乏归纳分析，
缺乏实际应用的可行性---无法实现预期目标。
老年性白内障是与年龄相关的疾病，随着年 龄的增加，其发病比率也不断升高。特别是人类 趋向老龄化，白内障的患病人数还将持续增加。 目前，它已是人类第一位的致盲疾病。迄今为止, 治疗白内障唯一有效的方法是通过手术摘除混浊 的晶状体并植入人工晶状体。虽然手术后患者可 以恢复良好的视力，但是不可避免的术后并发症 以及手术设备、材料耗资巨大，治疗白内障所花 费的资金已成为世界各国包括富裕的发达国家严 重的医疗负担。最近的调查表明，如果把老年性 白内障的发病时间延缓10年，白内障手术的数量 就会减少45%[1]。所以，一些学者认为通过预防 白内障发生或延缓其发展的途径征服白内障已成 为一项全球性的社会和社会经济问题[2]。
缺乏逻辑性和针对性---总结与表达不够。
撰写方法：要紧紧围绕本次申请项目的主题。 1、从疾病切入，简要论述国内外研究成果， 并引出当前的热点研究方向。 2、从研究方向展开，较详细地分析国内外在 本方向的研究进展，引出阐明疾病发病机理或发明 新的治疗方法的关键问题所在。 3、围绕关键问题，详细论述国内外以往的研 究结果、当前的现状及今后的发展趋势。综合分析 后提出目前尚未解决的问题。
上述三方面的研究均取得了不同程度的研究 结果，但由于当时技术条件的限制都未能全面阐 明与白内障相关的基因及其功能。 寻找白内障时晶状体上皮细胞与正常晶 状体上皮细胞间差异表达的基因有可能揭示白内 障的发病机理。
寻找差异表达基因的经典方法是消减杂交技术 （subtractive hybridization, SH），它是……，但 是实验操作复杂。 经过改进后的抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization ,SSH是Diatchenko等1996 我校生化教研室建立了改良消减杂交技术 [19，20]，其特点是：简便易行，能够获得目的细胞特 异表达的全长基因，对低丰度基因也能有效分离。
年建立的方法）……简化了实验操作，但仍然问题很多。
该方法的建立者已利用这一技术从脂多糖刺 激前后的人牙髓细胞的差异表达的基因中克隆到 脂多糖刺激后特异表达的基因，其中5个为新基 因。同理，利用此方法也能快速、有效地获得白 内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差 异表达的基因，并克隆到全长cDNA，为进一步的 结构和功能研究打下基础。
白内障的形成与晶状体的老化密不可分，是 晶状体老化的极端表现。晶状体的老化是多种因 素相互作用的结果，包括基因的和非基因的随机 变化的不断积累，也有程序性的、非随机性的组 织特异性多种基因表达的改变。目前，国内外对 白内障相关基因的研究主要以下三方面：
一是对体外培养的晶状体白内障模型及上 皮细胞的研究。UV-B辐射作用诱导的白内障中晶 状体上皮细胞是主要的靶细胞，其Na-K-ATP酶的 活性增加，蛋白质的合成和分泌增加；上皮细胞 的凋亡增加，其中有c-fos基因的表达增加；还 有组蛋白H4、H3 的低表达`和蛋白酶C、β-肌 动蛋白、γ-肌动蛋白基因的高表达[9-12]。 Carper等[13]利用RT-PCR-DD(reverse transcription-polymerase chain reaction differential display)技术研究H2O2诱导的晶 体上皮细胞的基因差异性表达结果显示NADH脱氢 酶4亚基、细胞色素b、谷氨酰胺转移酶基因表达 减少以及细胞因子的核蛋白、替代拼接因子2 （alternative splicing factor）、β-三羟基 异丁酰辅酶A水解酶基因表达的增加。
同行评议（一审）：
由基金委各学科处组织实施。基本程序： 每份申请书选择同行评议专家（5位）； 函请同行评议：对项目进行定性定量评价； 收回评议卡； 对定量部分进行计算机判读、打分、排序； 据学科资助项目数130％确定第二轮评审项目。
专家评审组或专业委员会评审（二审）。
主要对一审推荐项目进行评议，筛除 30％。
1、项目的研究意义
存在问题：对科学意义阐述不足或夸大。 撰写方法：从疾病入手，简述其特点、危 害， 目前主要的治疗方法及其存在的问题。 简要分析该病发病机理和主要研究热点，引 出 目前存在的主要问题，也就是本项目要解决的问 题，以此为切入点提出假设，阐述如果实现预期目 标，对该病甚至相关疾病的预防、治疗具有的理论
国家自然科学基金 申请讲座
第一部分
基金委面上项目 评审基本程序及重要环节
初
审： 由各学科处组织实施。
①申请者不具备申请资格或违反有关规定； ②手续不完备或申请书不符合要求; ③内容不符合资助范围或超出资助能力; ④申请者以往资助项目执行不利。
查
重：由基金委信息中心组织实施。
① 高职申请与承担（含参加）面上、重点、重大 累计不超过3项； ② 在职研究生不作为限项申请的条件但只可申请 面上项目； ③ 申请者同期只能申请一项，每个项目申请者限 为一人; ④ 高职申请者当年申请及承担的在研百度文库上项目累 计不超过两项; ⑤ 不具有高职的申请者申请及负责的在研面上项 目不超过一项; ⑥ 青年基金只能获得一项资助。
二、立论依据
对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述 项目科学意义 对应用基础研究，着重结合学科前沿，围绕国 民经济和社会发展中的重要科技问题论述其应用 前景
研究意义
在研究领域（疾病防治）层面 从研究领域（疾病防治）切入 从研究方向展开 围绕本项目拟解决的问题
立 据 依 论
进行归纳分析 提出设想
三是对人老年性白内障晶体上皮的研究。 Lee[17]利用RT-PCR技术研究显示前极性白内障 与核性白内障上皮细胞中纤维连接蛋白、I型胶 原纤维、α-平滑肌蛋白、TGF-β1、TGF-β2、 TGF-βⅡ型受体、结缔组织生长因子的基因表达 有差异。Kantorow等[18]利用RT-PCR-DD研究老 年性白内障与正常晶状体上皮的基因差异性表达 的初步结果是老年性白内障有三个高表达基因和 12个低表达的基因。但就DD-PCR技术来讲，在实 验中难以解决假阴性、假阳性以及克隆全长cDNA 的问题。
二是利用转基因动物的研究。波形纤维蛋白 基因（vimentin）、杂交的Ⅲ型中间纤维蛋白基 因的转基因小鼠表现出白内障，而且有随小鼠年 龄增加白内障加重的趋势。晶状体改变的共同特 点是晶状体纤维细胞分化受抑制[14,15]。Gong 等[16]报告晶状体的细胞膜蛋白连接蛋白α3 （α3 Connexin）基因敲除小鼠（knockout mouse）在晶状体形成的早期及纤维细胞分化早 期不受影响，其后出现与晶状体蛋白溶解有关的 核性白内障。虽然体外实验和白内障转基因小鼠 都提示我们一些基因的变化与白内障有关，但 是，这些变化的基因是否与老年性白内障形成有 关，目前尚缺乏进一步的报告。
因为晶状体上皮细胞是晶状体中唯一有分裂 活性、数量相对稳定的细胞，它们分裂、分化出 晶状体纤维细胞、产生晶体蛋白，终生不停息， 形成了晶状体均一、对称的结构，对维持晶状体 的透明起重要作用。不仅如此，晶状体上皮细胞 还是晶状体中受外来刺激影响较早的部位，已有 研究证实老年性白内障的晶状体上皮细胞还发生 退行性变、细胞膜通透性增加、细胞内酶活性改 变、细胞数量减少、凋亡细胞增多等改变，与单 纯老化的晶状体之间存在差异[3-5] 。
但是目前我们对老年性白内障发病机理的认 识还不十分清楚。多年以来许多学者的研究结果 证实晶状体上皮细胞在老年性白内障发生中起重 要的作用，但对其中进一步的基因调控知之甚少。 如果从参与老年性白内障晶状体上皮细胞变化的 相关基因入手，研究基因的生物学功能，有可能 抓住引起白内障发生、发展的主要环节。据此， 本研究拟利用改良的消减杂交技术和基因芯片技 术准确、全面、快速的特点，以晶状体上皮细胞 为研究对象，一次性筛选出老年性白内障全部有 差异表达的基因，从中再筛选出与白内障相关基 因，并着重对其功能进行研究，从基因水平阐明 白内障的发病机制，为防治白内障提供新思路和 理论依据。