细菌分离鉴定实验原理及操作注意事项(实验员)
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细菌分离鉴定实验原理及操作注意事项
科学、公正、精准
科学、公正、精准
*细菌分离鉴定实验的意义
1
*建立无菌概念，了解无菌操作
*常规病原菌的分离流程
2
*病原菌分离鉴定实验原理
3
*细菌对药物的敏感性试验
*细菌学实验操作注意事项
意义
超级耐药菌
确诊疾病
诊疗方案
健康养殖
涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度。 5、药敏实验方法多，选取最佳很重要。
科学、公正、精准
科学、公正、精准
区依次用接种环划线。 ②每划一个区域，应将接种环烧灼一次，待冷却后再划下一区域。每一
区域的划分应接触线应接触上一区域的接种线2—3次，使菌量逐渐减 少，以形成单个菌落。 ③划线完毕，将平板加盖，倒置，以适宜的培养条件培养。
科学、公正、精准
（2）液体培养基接种法（增菌法） 用棉签或接种环挑取病料或菌落，在试管壁和液面交界处轻轻研磨， 使菌团混匀在液体培养基中。
□ 抗菌药物敏感性试验（AST，药敏试验）
– 用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用 。常用最低抑菌浓度（MIC）表示，即体外能够抑制 细菌生长的最低药物浓度。
□ 方法：
扩散法（纸片法） 稀释法（琼脂稀释法和液体稀释法）
科学、公正、精准
试验方法
➢ 快速药敏试验：
由病料直接涂布药敏试验与病原菌分离同时进行（16-24h），可 根据药敏结果初步进行治疗。
细菌分离鉴定实验
科学、公正、精准
建立无菌观念
• 什么是无菌
无菌，指没有活菌的意思，又是生物技术中的一个重要概念。只有在 培养基、发酵设备等处于无菌的前提下，微生物接种后，才能实现纯 种培养，最终得到所需的产品。
科学、公正、精准
科学、公正、精准
接种方法
• 曲线划线法、分区划线法 • 倾注法、涂布法（细菌计数） • 斜面接种法（生化鉴定、保存菌种） • 穿刺培养法（生化鉴定、保存菌种） • 液体培养基接种法
科学、公正、精准
科学、公正、精准
科学、公正、精准
病原菌的分离鉴定
• 细菌分离培养
主要针对性用于临床发病动物组织脏器，粪便中的细菌时对某一种细 菌的分离，通过分离，使细菌在平板中分散生长，便于观察单个菌落 特性，也易挑取单个菌落，进行生化鉴定。
科学、公正、精准
1.基本条件 （1）接种用具：棉签、接种环、接种针、酒精灯 （2）培养箱：普通恒温培养箱 （3）无菌室和超净工作台 （4）培养基：营养琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂 2.接种方法 分区划线法 ①用棉签先将标本涂布在平板的第一区并作数次划线，再在二、三……
（3）倾注平板法 主要用于水质（饮水）的细菌计数 将灭菌生理盐水适量稀释（通常做10-1-10-4稀释）的水质1ml，置灭 菌平皿内，注入以灭菌溶化并冷却至50℃左右的培养基15ml，混匀 ，待冷却后，倒置。于37℃恒温培养箱中培养后，计数培养基内菌落 数，乘以稀释倍数，即可算出每毫升被检物的细菌数。
科学、公正、精准
大肠杆菌形态鉴定
科学、公正、精准
沙门氏菌形态鉴定
科学、公正、精准
巴氏杆菌形态鉴定
科学、公正、精准
链球菌形态鉴定
科学、公正、精准
葡萄球菌形态鉴定
科学、公正、精准
病原菌的生化鉴定
◇ 糖类发酵试验
原理：不同细菌含有发酵不同糖类的酶，分解糖能力不同，产生代谢物 不同，看细菌是否分解各类糖，是否产酸产气。
菌变混浊。若变混浊，用接种环挑取菌液，无菌操作划线接种于麦 康凯琼脂、SS琼脂，37℃培养12-24h，观察是否有细菌生长，初 步判定感染病原菌的类型。
科学、公正、精准
操作过程 • （3）涂板、贴纸片：
用灭菌棉签沾取稀释的培养液，在管壁清碰几下，挤掉多余水分， 均匀涂抹于营养琼脂平板上，反复几次，每次将平板旋转60度，最后 沿周边绕两圈，保证涂均匀，并贴上药敏纸片，37℃倒置培养 8 18h，观察结果。
科学、公正、精准
大肠杆菌细菌分离
粉红色或深红色、圆形隆起、光滑湿润、 黑色带有金属光泽，圆形隆起 边缘整齐；
科学、公正、精准
沙门氏菌细菌分离
圆形、微凸、边缘整齐、直径在1～ 2 mm的小菌落，菌落无色透明、 淡黄色透明或外周透明中心黑色
科学、公正、精准
蓝绿色或蓝色菌落，产硫化氢菌 株菌落中心带黑色
•
＜10 mm 不敏
• 选药原则：敏感而价格低的药，实际的运用
• 过程中应交叉给药，以减少耐药菌株的产生
科学、公正、精准
科学、公正、精准
科学、公正、精准
细菌学实验操作注意事项
1、无菌观念要加强，双重保护很重要。 2、发病前期好时机，最好三两混合取。 3、细菌分离常练习，分离手法越熟练。 4、染色三不过
科学、公正、精准
操作过程
前增菌药敏试验
（1）样品处理： • 用灭菌棉签沾取组织内部，然后打开装有增菌液（营养肉汤）的
管子，使增菌液与棉签充分混匀，盖上盖子，做好标记，放入恒温 箱中37℃培养12-24小时，此肉汤菌液为前增菌液。
（2）细菌分离培养： • 待取出装有沾取病变组织灭菌棉签的试管，观察营养肉汤中的细
科学、公正、精准
•（4） 结果观察、判定标准
• 抑菌圈：用游标卡尺从平板背面精确测量各个抑菌圈直径（精确到 0.01mm），抑菌圈的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。原料药判 定按《抗微生物药物敏感性试验执行标准2010》
• 成品药判定标准 ： ﹥20 mm 极敏
•
15-20 mm 高敏
•
10-14 mm 中敏
实验室分离
链球菌在血液琼脂中生长为无色透明、 圆形、光滑、隆起的露滴状小菌落
科学、公正、精准
巴氏杆菌在血琼脂平板生长为 淡灰白色，闪光的露珠状小菌 落
Hale Waihona Puke Baidu
形态学检查
• 染色标本的检查
通过对标本的涂片及染色观察细菌的形态、大小、排列、染色特性， 一及荚膜、鞭毛、芽孢、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步识别或 诊断。 1.涂片：从肉汤或平板上挑取菌液或菌落，涂布在滴有生理盐水的玻片 上，涂片厚薄适当。 2.固定：涂片干燥后，在火焰上迅速通过3次，加热固定。 3.染色：滴加染液覆盖菌膜。 4.脱色：乙醇是最常用的脱色剂，70%乙醇和无机酸脱色能力强。 5.复染：复染可使脱色的细菌重新着色。
◇ 葡萄糖代谢类型鉴别试验
原理：又称氧化/发酵试验，观察细菌对葡萄糖分解过程中是利用分子氧 （氧化性），还是无氧酵解（发酵型），或不分解葡萄糖（产碱性）
◇ 三糖铁试验
原理：三糖铁用于观察细菌对糖的发酵能力，以及是否产生硫化氢，可 初步鉴定细菌的菌属。
科学、公正、精准
生化鉴定
科学、公正、精准
细菌对药物的敏感性试验
科学、公正、精准
• 常用的染色方法
革兰氏染色法：最常用的一种染色方法 （1）染色步骤 ①结晶紫初染：结晶紫染色1.5min，水洗，甩干 ②碘液媒染：碘液染色2min，水洗，甩干 ③酒精脱色：95%乙醇脱色，20—30s，脱色到无结晶紫为止，水洗，
甩干 ④石碳酸复红复染：石碳酸复红染色1.5min ，水洗，吸水纸吸干。 （2）结果 革兰氏阳性蓝紫色，革兰氏阴性紫红色。
➢ 前增菌法药敏试验：
挑取组织培养后菌落，放于灭菌肉汤培养液中，涂抹进行药敏实验 8-12h后观察结果。
➢ 传统法药敏试验：
耗时较长（2-3天），对于一般养殖场定期监测病原菌及其敏感性 时，可以使用此方法。能较好地分离出病原菌，病原菌经纯培养后 ，进行药敏试验，得出的数据可以准确反应出病原菌对某一药物的 敏感性。
细菌分离鉴定实验原理及操作注意事项
科学、公正、精准
科学、公正、精准
*细菌分离鉴定实验的意义
1
*建立无菌概念，了解无菌操作
*常规病原菌的分离流程
2
*病原菌分离鉴定实验原理
3
*细菌对药物的敏感性试验
*细菌学实验操作注意事项
意义
超级耐药菌
确诊疾病
诊疗方案
健康养殖
涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度。 5、药敏实验方法多，选取最佳很重要。
科学、公正、精准
科学、公正、精准
区依次用接种环划线。 ②每划一个区域，应将接种环烧灼一次，待冷却后再划下一区域。每一
区域的划分应接触线应接触上一区域的接种线2—3次，使菌量逐渐减 少，以形成单个菌落。 ③划线完毕，将平板加盖，倒置，以适宜的培养条件培养。
科学、公正、精准
（2）液体培养基接种法（增菌法） 用棉签或接种环挑取病料或菌落，在试管壁和液面交界处轻轻研磨， 使菌团混匀在液体培养基中。
□ 抗菌药物敏感性试验（AST，药敏试验）
– 用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用 。常用最低抑菌浓度（MIC）表示，即体外能够抑制 细菌生长的最低药物浓度。
□ 方法：
扩散法（纸片法） 稀释法（琼脂稀释法和液体稀释法）
科学、公正、精准
试验方法
➢ 快速药敏试验：
由病料直接涂布药敏试验与病原菌分离同时进行（16-24h），可 根据药敏结果初步进行治疗。
细菌分离鉴定实验
科学、公正、精准
建立无菌观念
• 什么是无菌
无菌，指没有活菌的意思，又是生物技术中的一个重要概念。只有在 培养基、发酵设备等处于无菌的前提下，微生物接种后，才能实现纯 种培养，最终得到所需的产品。
科学、公正、精准
科学、公正、精准
接种方法
• 曲线划线法、分区划线法 • 倾注法、涂布法（细菌计数） • 斜面接种法（生化鉴定、保存菌种） • 穿刺培养法（生化鉴定、保存菌种） • 液体培养基接种法
科学、公正、精准
科学、公正、精准
科学、公正、精准
病原菌的分离鉴定
• 细菌分离培养
主要针对性用于临床发病动物组织脏器，粪便中的细菌时对某一种细 菌的分离，通过分离，使细菌在平板中分散生长，便于观察单个菌落 特性，也易挑取单个菌落，进行生化鉴定。
科学、公正、精准
1.基本条件 （1）接种用具：棉签、接种环、接种针、酒精灯 （2）培养箱：普通恒温培养箱 （3）无菌室和超净工作台 （4）培养基：营养琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂 2.接种方法 分区划线法 ①用棉签先将标本涂布在平板的第一区并作数次划线，再在二、三……
（3）倾注平板法 主要用于水质（饮水）的细菌计数 将灭菌生理盐水适量稀释（通常做10-1-10-4稀释）的水质1ml，置灭 菌平皿内，注入以灭菌溶化并冷却至50℃左右的培养基15ml，混匀 ，待冷却后，倒置。于37℃恒温培养箱中培养后，计数培养基内菌落 数，乘以稀释倍数，即可算出每毫升被检物的细菌数。
科学、公正、精准
大肠杆菌形态鉴定
科学、公正、精准
沙门氏菌形态鉴定
科学、公正、精准
巴氏杆菌形态鉴定
科学、公正、精准
链球菌形态鉴定
科学、公正、精准
葡萄球菌形态鉴定
科学、公正、精准
病原菌的生化鉴定
◇ 糖类发酵试验
原理：不同细菌含有发酵不同糖类的酶，分解糖能力不同，产生代谢物 不同，看细菌是否分解各类糖，是否产酸产气。
菌变混浊。若变混浊，用接种环挑取菌液，无菌操作划线接种于麦 康凯琼脂、SS琼脂，37℃培养12-24h，观察是否有细菌生长，初 步判定感染病原菌的类型。
科学、公正、精准
操作过程 • （3）涂板、贴纸片：
用灭菌棉签沾取稀释的培养液，在管壁清碰几下，挤掉多余水分， 均匀涂抹于营养琼脂平板上，反复几次，每次将平板旋转60度，最后 沿周边绕两圈，保证涂均匀，并贴上药敏纸片，37℃倒置培养 8 18h，观察结果。
科学、公正、精准
大肠杆菌细菌分离
粉红色或深红色、圆形隆起、光滑湿润、 黑色带有金属光泽，圆形隆起 边缘整齐；
科学、公正、精准
沙门氏菌细菌分离
圆形、微凸、边缘整齐、直径在1～ 2 mm的小菌落，菌落无色透明、 淡黄色透明或外周透明中心黑色
科学、公正、精准
蓝绿色或蓝色菌落，产硫化氢菌 株菌落中心带黑色
•
＜10 mm 不敏
• 选药原则：敏感而价格低的药，实际的运用
• 过程中应交叉给药，以减少耐药菌株的产生
科学、公正、精准
科学、公正、精准
科学、公正、精准
细菌学实验操作注意事项
1、无菌观念要加强，双重保护很重要。 2、发病前期好时机，最好三两混合取。 3、细菌分离常练习，分离手法越熟练。 4、染色三不过
科学、公正、精准
操作过程
前增菌药敏试验
（1）样品处理： • 用灭菌棉签沾取组织内部，然后打开装有增菌液（营养肉汤）的
管子，使增菌液与棉签充分混匀，盖上盖子，做好标记，放入恒温 箱中37℃培养12-24小时，此肉汤菌液为前增菌液。
（2）细菌分离培养： • 待取出装有沾取病变组织灭菌棉签的试管，观察营养肉汤中的细
科学、公正、精准
•（4） 结果观察、判定标准
• 抑菌圈：用游标卡尺从平板背面精确测量各个抑菌圈直径（精确到 0.01mm），抑菌圈的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。原料药判 定按《抗微生物药物敏感性试验执行标准2010》
• 成品药判定标准 ： ﹥20 mm 极敏
•
15-20 mm 高敏
•
10-14 mm 中敏
实验室分离
链球菌在血液琼脂中生长为无色透明、 圆形、光滑、隆起的露滴状小菌落
科学、公正、精准
巴氏杆菌在血琼脂平板生长为 淡灰白色，闪光的露珠状小菌 落
Hale Waihona Puke Baidu
形态学检查
• 染色标本的检查
通过对标本的涂片及染色观察细菌的形态、大小、排列、染色特性， 一及荚膜、鞭毛、芽孢、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步识别或 诊断。 1.涂片：从肉汤或平板上挑取菌液或菌落，涂布在滴有生理盐水的玻片 上，涂片厚薄适当。 2.固定：涂片干燥后，在火焰上迅速通过3次，加热固定。 3.染色：滴加染液覆盖菌膜。 4.脱色：乙醇是最常用的脱色剂，70%乙醇和无机酸脱色能力强。 5.复染：复染可使脱色的细菌重新着色。
◇ 葡萄糖代谢类型鉴别试验
原理：又称氧化/发酵试验，观察细菌对葡萄糖分解过程中是利用分子氧 （氧化性），还是无氧酵解（发酵型），或不分解葡萄糖（产碱性）
◇ 三糖铁试验
原理：三糖铁用于观察细菌对糖的发酵能力，以及是否产生硫化氢，可 初步鉴定细菌的菌属。
科学、公正、精准
生化鉴定
科学、公正、精准
细菌对药物的敏感性试验
科学、公正、精准
• 常用的染色方法
革兰氏染色法：最常用的一种染色方法 （1）染色步骤 ①结晶紫初染：结晶紫染色1.5min，水洗，甩干 ②碘液媒染：碘液染色2min，水洗，甩干 ③酒精脱色：95%乙醇脱色，20—30s，脱色到无结晶紫为止，水洗，
甩干 ④石碳酸复红复染：石碳酸复红染色1.5min ，水洗，吸水纸吸干。 （2）结果 革兰氏阳性蓝紫色，革兰氏阴性紫红色。
➢ 前增菌法药敏试验：
挑取组织培养后菌落，放于灭菌肉汤培养液中，涂抹进行药敏实验 8-12h后观察结果。
➢ 传统法药敏试验：
耗时较长（2-3天），对于一般养殖场定期监测病原菌及其敏感性 时，可以使用此方法。能较好地分离出病原菌，病原菌经纯培养后 ，进行药敏试验，得出的数据可以准确反应出病原菌对某一药物的 敏感性。