HMGB1对人肝癌细胞增殖及转移能力的影响

网络出版时间：2012-11-08 16:08
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HMGB1对人肝癌细胞增殖及转移能力的影响
刘亚萍，董蕾，史海涛，刘欣，鲁晓岚，姜炅
（西安交通大学医学院第二附属医院消化科，陕西西安710004)
摘要：目的观察高迁移率族蛋白1（HMGB1）对人肝癌细胞株HepG2体外增殖及转
移能力的影响，并阐明其可能的作用机制。

方法MTT法检测细胞增殖能力及细胞对
Matrigel基质胶的粘附能力；Transwell小室模型测定细胞侵袭及迁移能力；Western blot
和逆转录PCR（RT-PCR）分别检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶
9(MMP-9)和血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白及mRNA表达情况。

结果HepG2经不
同质量浓度（10、100、1000ng/mL)的重组人HMGB1（rHMGB1）干预，24、48、72h
细胞增殖能力均明显高于对照组（P<0.01）；随着时间和浓度的增加，细胞增殖能力逐
渐增强。

100ng/mL的rHMGB1干预HepG2 48h，细胞对Matrigel基质胶的粘附能力较
对照组明显增高(P<0.01)，侵袭和迁移实验中穿膜细胞数均明显多于对照组(P<0.01)。

此外，rHMGB1可明显上调MMP-9和VEGF的蛋白及mRNA表达水平(P<0.01)，但
MMP-2的蛋白及mRNA表达与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

结论HMGB1
可促进人肝癌细胞的增殖、粘附、侵袭及迁移能力，这可能与上调MMP-9和VEGF
蛋白及mRNA表达水平有关。

关键词：HMGB1；肝癌细胞；增殖；肿瘤转移；基质金属蛋白酶2(MMP-2)；基质金
属蛋白酶9(MMP-9)；血管内皮生长因子(VEGF)
中图分类号：R735 文献标志码：A 文章编号：1671-8259
Effects of HMGB1 on proliferative and metastatic abilities of hepatoma cell line HepG2 LIU Ya-ping, DONG Lei, SHI Hai-tao, LIU Xin, LU Xiao-lan, JIANG Jiong
(Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital,
Medical School of Xi’an Jiao tong University, Xi'an 710004, China)
收稿日期：2012-05-20 修回日期：2012-09-16
基金项目：国家自然科学基金青年基金（No.81200310）
Supported by the Youth Fund of National Natural Science Foundation of China (No.81200310) 通讯作者：董蕾，主任医师，E-mail：dong556 @
作者简介：刘亚萍（1985-），女（汉族），硕士研究生，主要研究慢性肝病及胃肠动力.
E-mail: liuyaping5222491 @
ABSTRACT: Objective To investigate effects of high mobility group box-1 (HMGB1) on the proliferative and metastatic abilities of hepatoma cell line HepG2 in vitro and analyze the possible mechanisms. Methods MTT was used for determining the proliferative and adhesive abilities of HepG2. The invasive and migratory abilities were detected by Transwell assay. The expressions of MMP-2, MMP-9 and vascular endothelial growth factor (VEGF) at protein and mRNA levels were evaluated by Western blot and reverse transcription (RT-PCR), respectively. Results HepG2's proliferative ability in response to rHMGB1 of different concentration (10, 100 and 1000ng/mL) was significantly higher than that in the control group at 24, 48 and 72h (P<0.01), and it increased with the rise of treatment concentration and time. HepG2 was treated by rHMGB1 (100ng/mL) for 48 h to detect the adhesive, invasive and migratory abilities. Compared to that in the control group, the adhesive ability of HepG2 to Matrigel was significantly elevated (P<0.01) and the number of invasive and migratory cells was remarkably increased (P<0.01). In addition, the expressions of MMP-9 and VEGF at protein and mRNA levels were significantly up-regulated (P<0.01), but there was no difference in MMP-2 (P>0.05). Conclusion The proliferative, adhesive, invasive and migratory abilities of hepatoma cells can be promoted by HMGB1, which may be related to up-regulating the protein and mRNA expressions of MMP-9 and VEGF.
KEY WORDS: high mobility group box-1 (HMGB1); hepatoma cell; proliferation; tumor metastasis; MMP-2; MMP-9; vascular endothelial growth factor (VEGF)
高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1, HMGB1）是真核细胞核内的非组蛋白染色质结合蛋白，在维持核小体结构的稳定和DNA重组、复制、修复及基因转录中发挥着重要作用[1]。

HMGB1不仅作用于细胞内，还可以通过坏死细胞被动释放或免疫
[2]，其过表达可抑制细胞凋亡，诱导细胞增殖及分化[3]。

新近研究表明HMGB1高表达于多种肿瘤组织[4]，参与肿瘤细胞的生长、浸润和迁移等生物学特性，具有重要的临床意义[5]。

原发性肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，全球发病率逐年增长。

其起病隐匿、恶性程度高，对于晚期肝癌患者来说手术效果欠佳、预后差，因此分子靶向治疗等生物治疗方法成为近年来研究的热点[6]，HMGB1作为一种新发现的肿瘤分子靶点，已有研究表明其在肝癌组织中有明显的表达[4]，但其对肝癌细胞的增殖及转移等生物学特性方面的影响尚不清楚。

本研究即通过体外培养人肝癌细胞HepG2，观察HMGB1对其
增殖、粘附、侵袭、迁移及血管生成等方面的影响，旨在探讨HMGB1对肝癌细胞增殖及转移能力的影响，并阐明其可能的作用机制，为肝癌的发病机制及治疗提供一种新的思路。

1 材料与方法
1.1 材料人肝癌HepG2 (购自中科院上海细胞生物研究所，由西安交通大学医学院实验中心保存)；rHMGB1(Prospec，以色列)；RPMI1640 (Hyclone，美国)；胎牛血清(FBS,杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰酶(Sigma，美国)；Transwell小室、96孔板及24孔板、6孔板(Coning，美国)；MTT(Sigma，美国)；DMSO(Sigma，美国)；Matrigel 基质胶(BD公司，美国)；蛋白提取RIPA改良试剂盒(西安沃尔森技术有限公司)；Western blot用β-Actin(内参)、MMP-2、MMP-9及VEGF鼠抗人多克隆一抗及辣根过氧化物酶山羊抗鼠第二抗体(Bioworld Technology，美国)；RNA提取试剂盒Fastgen200(上海飞捷生物技术有限公司)；逆转录试剂盒(Fermentas，美国)；MMP-9、MMP-2、VEGF基因引物(北京奥科生物技术有限公司)；Premix Taq(大连宝生物工程有限公司)；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养于37℃、50mL/L CO2饱和湿度的培养箱中，用含100mL/L FBS的RPMI1640培养HepG2，2～3d后用
2.5g/L胰酶消化并传代，选取对数生长期细胞用于实验。

以下所有实验均重复至少3次。

1.3 MTT法检测细胞增殖实验[7]调整HepG2细胞密度至5×104/mL，接种于96孔板，每孔100μL，培养12h待细胞贴壁后，换为含不同质量浓度(0、10、100、1000ng/mL)rHMGB1的无血清RPMI1640培养液继续培养，分别干预24、48、72h，于各孔中加入MTT 20μL，37℃孵箱中孵育4h后弃去孔内液体，每孔加入DMSO150μL，摇床上低速振荡10min，在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光度值(A值)。

每组设6个复孔。

1.4 细胞粘附实验[8-9]用无血清的冷RPMI1640按1∶5稀释Matrigel基质胶，每孔100μL加入96孔板，室温干燥过夜制成Matrigel包被的96孔板。

100ng/mL rHMGB1干预HepG2 48h后经
2.5g/L胰酶消化，并调整细胞密度至1×105/mL，接种于Matrigel 包被的96孔板中，每孔100μL，37℃孵箱中孵育4h后用PBS溶液冲洗2遍，显微镜下观察细胞粘附情况，用MTT法分析，方法同细胞增殖实验。

以无血清的培养液作为
空白对照调零组，对照组和干预组各设6个复孔。

细胞粘附率(%)=[(干预组A值－对照组A值)/对照组A值]×100%。

1.5 细胞侵袭及迁移实验[8-9]用无血清的冷RPMI 1640按1∶5稀释Matrigel基质胶，将Transwell小室置于24孔板中，取100μL稀释胶加至上室，室温干燥过夜。

HepG2经100ng/mL的rHMGB1干预48h，
2.5g/L胰酶消化后用无血清的RPMI1640调整细胞密度至3×105/mL，于铺胶的上室中加入100μL细胞悬液，下室加入600μL含200mL/L FBS的RPMI1640，对照组和干预组分别平行设置3个小室，37℃、50mL/L CO2饱和湿度的孵育箱中孵育48h，用棉签擦去小室滤膜内表面未穿过的细胞，用结晶紫将外表面细胞染色，取5个视野(上、中、下、左、右)照相并计数。

细胞迁移实验中除Transwell 小室不铺胶外，余方法同侵袭实验。

细胞侵袭或迁移率(%)=[(干预组穿膜细胞数－对照组穿膜细胞数)/对照组穿膜细胞数]×100%。

1.6 Western blot检测MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表达100ng/mL的rHMGB1干预HepG2 48h，加入细胞裂解液，冰上裂解1h后离心(12000r/min，20min)，取上清液作为细胞总蛋白，80g/L的聚丙稀酰胺凝胶中电泳，之后将蛋白分别电转移至硝酸纤维膜上，50g/L脱脂奶粉封闭后分别加入β-Actin(内参)、MMP-2、MMP-9及VEGF鼠抗人多克隆一抗（1∶1000稀释），再分别与相应的二抗结合，用化学发光法检测阳性条带。

结果用Gel-pro分析软件进行分析，计算目的蛋白与相应内参的灰度值比值。

1.7 RT-PCR检测MMP-2、MMP-9、VEGF mRNA表达β-Actin(内参)、MMP-2、MMP-9、VEGF的基因引物序列见表1。

浓度为100ng/mL的rHMGB1干预HepG2 48h后用Fastgen200试剂盒提取细胞总RNA，并按照Fermentas逆转录试剂盒操作说明合成相应的cDNA。

PCR反应体系包括模板cDNA 1μL、前引物1μL、后引物1μL、Premix Taq 9.5μL及ddH2O 1
2.5μL，总体积25μL，反应条件为预变性94℃ 5min；变性94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 30s，共30个循环；再延伸72℃ 5min。

PCR产物于20g/L的琼脂糖凝胶上电泳(120V，80mA)，将凝胶电泳图像输入凝胶定量软件Gel-Pro分析软件进行分析，获取各条带的灰度值，计算其相对灰度值。

计算公式如下：相对灰度值=各组对应泳道灰度值/各组对应内参灰度值。

表1 RT-PCR所用基因引物序列及产物长度
Tab.1 The primer sequence and length of products for RT-PCR
基因长度(bp)引物序列产物
β-Actin 上游5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG -3′
179 下游5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′
MMP-2上游5′-TTGGTGGGAACTCAGAAGG-3′
140 下游5′-CTTGCGGTCATCATCGTA-3′
MMP-9上游5′-TGACAGCGACAAGAAGTG -3′
143 下游5′- CAGTGAAGCGGTACATAGG -3′
图1 细胞增殖能力比较图
Fig.1 Comparison of cell proliferative ability
2.2 细胞粘附能力比较采用A490nm值的大小反映细胞粘附能力，值越大表明细胞粘附能力越强。

HepG2经100ng/mL的rHMGB1干预48h后，显微镜下可见粘附于Matrigel 基质胶的细胞数明显多于对照组，测A490nm值与对照组相比明显增高（0.57±0.04 vs.
0.36±0.03）(t=7.58，P<0.01)，其粘附率为(69.27±0.12)%（图2）。

图2 细胞粘附能力比较图
Fig.2 Comparison of cell adhesive ability
与对照组相比，▲P＜0.01。

2.3 细胞侵袭能力和迁移能力比较采用穿膜细胞数多少代表侵袭及迁移能力的大小。

与对照组相比，rHMGB1干预组细胞通过侵袭穿膜细胞数量明显增加[(392.67±2.52）vs.（144.67±
3.21)个/视野] (t=49.37，P<0.01，图3)，其侵袭率为(171.34±1.57)%；细胞通过迁移穿膜细胞数量亦明显多于对照组[(542.33±
4.51)vs.(168.38±6.22)个/视野](t=40.75，P<0.01，图3)，其迁移率为(220.29±2.16)%。

图3 侵袭及迁移穿膜细胞数的比较
Fig.3 Comparison of the number of invasive and migratory cells（×100）
2.4 MMP-2、MMP-9及VEGF蛋白表达的比较rHMGB1干预HepG2 48h后，MMP-2、MMP-9及VEGF的蛋白均有表达，其中MMP-9及VEGF蛋白表达明显高于对照组(其中MMP-9 t=10.42，VEGF t=8.89，均P<0.01)，MMP-2的蛋白表达量与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05，图4))。

图4 MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表达的比较
Fig.4 Comparison of MMP-2, MMP-9 and VEGF protein expression
1：对照组；2：rHMGB1干预组。

与对照比较，●P>0.05，▲P＜0.01。

2.5 MMP-2、MMP-9及VEGF mRNA表达的比较rHMGB1干预HepG2 48h后，MMP-2、MMP-9及VEGF的mRNA均有表达；其中MMP-9及VEGF的mRNA表达明显高于对照组(其中MMP-9 t=9.12，VEGF t=10.49，均P<0.01)，但MMP-2的mRNA 表达量与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05，图5)。

图5 MMP-2、MMP-9、VEGF mRNA表达比较图
Fig.5 Comparison of MMP-2, MMP-9 and VEGF mRNA expression
1：对照组；2：rHMGB1干预组。

与对照比较，●P>0.05，▲P＜0.01。

3 讨论
恶性肿瘤的预后主要取决于癌细胞的增殖及转移能力。

随着肿瘤细胞不断增殖，肿瘤组织内部压力增高，癌细胞间同质型粘附降低，但与细胞外基质间的异型粘附增加，同时在细胞外水解酶的作用下降解细胞外基质并穿透基质及血管壁的基底膜进入血液或淋巴循环，在循环中逃避免疫系统识别与破坏从而到达靶器官微小血管中，随即穿出血管即可形成微小转移灶，肿瘤血管的形成又使得转移癌灶继续增殖，当增殖到一定大小又开始向别处转移[10]。

由此可见，肿瘤转移的发生必须具备增殖、粘附、侵袭、迁移及血管生成的能力，本研究即通过检测人肝癌细胞HepG2的增殖、粘附、侵袭及迁移能力，以观察细胞的增殖及转移情况，研究中采用Matrigel基质胶模拟细胞外基质，用Transwell小室体外浸润模型来模拟肿瘤细胞的侵袭及迁移过程。

近年来研究发现，HMGB1是一种与肿瘤增殖和转移存在密切关系的染色体蛋白，已发现其在胰腺癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌及宫颈癌等多种肿瘤组织中均有表达，且表达水平明显高于癌旁组织和正常组织，此外研究表明HMGB1的表达与癌灶大小、
浸润及转移有关。

CHENG[11]等通过对68例胰腺癌患者检测表明：患者血清中和组织HMGB1的表达水平均增高，且高表达HMGB1的肿瘤细胞容易进入血管内，参与胰腺癌的血行转移。

KUNIYASU[12]等观察了96例结肠癌标本，发现HMGB1的表达主要集中于肿瘤具有侵袭性的组织边缘，与肿瘤浸润深度及有无淋巴结转移密切相关。

HIROKI[13]等研究表明胃癌细胞株MKN1、MKN7、MKN28等均有HMGB1的表达，且其表达水平与胃癌转移能力相关。

NORA[4]等通过免疫组化实验表明HMGB1高表达于肝癌组织，本研究通过rHMGB1干预HepG2后检测其对HepG2增殖及转移能力的影响，结果表明HMGB1能够显著增加HepG2的增殖能力，且随着浓度和时间的增加细胞增殖能力逐渐增强，同时干预后的细胞粘附、侵袭和迁移能力均明显提高。

此外，在肿瘤转移过程中，MMPs及VEGF起着至关重要的作用。

MMPs是一种锌离子依赖的内分泌蛋白酶，主要参与细胞间黏附调节、细胞外基质的降解、新血管的形成[14]。

目前发现MMPs家族成员己达20多种，其中MMP-2、MMP-9主要降解细胞外基质中的Ⅳ胶原，在肝癌组织中呈现高表达，并与肝癌的浸润转移及预后密切相关[15-16]。

VEGF是一种多功能的血管生成因子，通过刺激血管内皮细胞分裂增殖达到促进肿瘤血管生成和重建，从而为肿瘤的生长提供营养，同时可以使血管通透性增加，为肿瘤的浸润转移提供有利的条件[17]。

VEGF在人类几乎所有恶性肿瘤包括肝癌组织中呈高表达，高水平的VEGF与恶性肿瘤患者的预后密切相关[18]。

本研究检测MMP-2、MMP-9及VEGF的蛋白及mRNA表达水平能力，结果表明HMGB1对HepG2增殖及转移能力增强与上调MMP-9及VEGF的表达增高有关，但与MMP-2的表达水平却无明显的关系，这可能于HMGB1小剂量（纳克级）干预导致的差异不明显有关。

以上研究结果提示HMGB1与肝癌的增殖和转移能力密切相关，有可能成为肝癌治疗中一个重要的靶点。

目前国内外研究表明，HMGB1主要通过两种受体参与肿瘤的生物学效应，分别为晚期糖基化产物受体（receptor for advanced glycation end products, RAGE）和Toll样受体4（toll like receptors-4, TLR4）[19]，其下游信号通路如NF-κB、JNK、MAPK等在肿瘤增殖和转移中发挥着重要的作用[20]。

HMGB1是通过哪种受体发挥作用，以及其是否激活这些信号通路而促进肝癌增殖和转移，将是本课题后续深入的进一步研究计划。

参考文献：
[1]JESSICA EE, CHARLES KB, MICHAEL DV, et al. Masquerader: High mobility group
box-1 and cancer [J]. Clin Cancer Res, 2007, 13(10):2836-2848.
[2]ΜLLOA L, MESSMER D. High-mobility group box 1 (HMGB1) protein: friend and foe
[J]. Cytokine Growth F R, 2006, 17(3):189–201.
[3]CHARLES WB, JIANG WW, CHARLES FR, et al. The extracellular release of HMGB1
during apoptotic cell death [J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2006, 291(6):1318-1325. [4]NORA K, STANISLA VA Z, IV A U, et al. The expression of HMGB1 protein and its
receptor RAGE in human malignant tumors [J]. Mol Cell Biochem, 2010, 337(1-2):251–258.
[5]TANG DL, KANG R, HERBERT J, et al. High-mobility group box 1 and cancer [J].
Biochimica et Biophysica Acta, 2010, 1799(1-2):131–140.
[6]MELANIE T. Molecular targeted therapy for hepatocellular carcinoma [J]. J
Gastroenterol, 2009, 44(4):136-141.
[7]W ANG FZ, FEI HR, LIAN LH, et al. Hepatitis B x-interacting protein induces HepG2
cell proliferation through activation of the phosphatidylinositol-3 kinase/Akt pathway [J].
Exp Biol Med, 2011, 236(1):62-69.
[8]KILLEEN SD, W ANG JH, ANDREWS EJ, et al. Bacterial endotoxin enhances colorectal
cancer cell adhesion and invasion through TLR-4 and NF-κB dependent activation of theurokinase plasminogen activator system [J]. Brit J Cancer, 2009, 100(10):589-602. [9]SHIH YW, LEE YC, WU PF, et al. Plumbagin inhibits invasion and migration of liver
cancer HepG2 cells by decreasing productions of matrix metalloproteinase-2 and urokinase-plasminogen activator [J]. Hepatol Res, 2009, 39(10):998–1009.
[10]CHRISTINE LC, ROBERT AW. A perspective on cancer cell metastasis [J]. Science,
2011, 331(6024):1559-1563.
[11]程宝泉, 李延青, 李文捷, 等. 胰腺癌HMGBl表达及其与血行转移的关系研究[J].
中华胰腺病杂志, 2008, 8(5):308-311.
[12]TOMONORI S, YOSHIHIKO A, KIYOMU F, et al. Expression of receptor for advanced
glycation end products and HMGB1/amphoterin in colorectal adenomas [J]. Virchows Arch, 2005(4), 446:411-415.
[13]KUNIYASU H, OUE N, W AKIKAW A A, et al. Expression of receptors for advanced
glycation end-products (RAGE) is closely associated with the invasive and metastatic activity of gastric cancer [J]. J Pathol, 2002, 196(1):163-170.
[14]DERYUGINA EI, QUIGLEY JP. Quigley, matrix metalloproteinases and tumor
metastasis [J]. Cancer Metastas Rev, 2006, 25(1):9-34.
[15]DENIZ N, BANU Y, FUNDA Y, et al. Expression of matrix metalloproteinase predicting
prognosis of hepatocellular carcinoma after liver transplantation [J]. Liver Transplantation, 2010, 16(5):621-630.
[16]KAREN MFS, KRIS LTW, GLANICE KYC, et al. Loss of phosphatase and tensin
homolog enhances cell invasion and migration through AKT/Sp-1transcription factor/matrix metalloproteinase 2 activation in hepatocellular carcinoma and has clinicopathologic significance[J]. Hepatology, 2011, 53(5):1558-1569.
[17]IW ASAKI J, NIHIRA S. Anti-angiogenic therapy against gastrointestinal tract cancers
[J]. Jpn J Clin Oncol, 2009, 39(9):543-551
[18]DUDAL DG, BA TCHELOR TT, CHRISTOPHER G. et al. VEGF-targeted cancer
therapy strategies:current progress, hurdles and future prospects [J]. Trends in Molecular Medicine, 2007, 16(6):223-230.
[19]JUDY R. V AN B, WIM A. Buurman, Arjan W. Griffioen. Convergence and amplification
of toll-like receptor (TLR) and receptor for advanced glycation end products (RAGE) signaling pathways via high mobility group B1 (HMGB1) [J]. Angiogenesis, 2008, 11(1):91-99.
[20]GONG HJ, PAOLO ZL, ANVESH K, et al. Analysis and verification of the HMGB1
signaling pathway [J]. BMC Bioinformatics, 2010, 11(7):3-13.
（编辑国荣）。