2020年(生物科技行业)微生物饲料添加剂

（生物科技行业）微生物饲

料添加剂

微生物饲料添加剂乳酸菌的微生物学检验

壹、概述

乳酸细菌是壹类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。乳酸细菌主要包括23个属，通常在饲料中用作有益微生物的菌种有干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）、粪肠球菌(Enterococcusfaecium)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、俩歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、屎肠球菌（Enterococcusfaecium）、乳酸乳杆菌(LactococcusLactis)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)等。

乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。APT培养基通常用于分离绿色乳杆菌和其他乳杆菌及肉食杆菌。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基，仍有利用磺胺二甲恶唑、制大肠菌素和结晶紫等作为选择因子。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。此外仍有如溴甲酚紫培养基、CHALMERS培养基等也常用于乳酸菌的分离。

以下举几个例子来说明乳酸菌的作用及特性。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属（Lactobacillus）的壹个种。其特性为：杆菌，俩端圆，不运动，无鞭毛，接触酶阴性，和苦杏仁苷、纤维二糖、七叶灵、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、水杨苷、蔗糖反应为阴性，阿拉伯糖、葡糖酸盐、甘露醇、松三糖、鼠李糖、核糖、山梨糖、木糖反应为阴性。由于嗜酸乳杆菌在生长中能够产生壹些抑菌物质，如有机酸、细菌素及类细菌素，能够抑制肠道中有害微生物生长繁殖，起到平衡肠道菌群的作用。且能产生B族维生素，包括各种叶酸、生物素、维生素B6和维生素K等，分泌各种有益物质，如乳酸、乙酸等，降低肠道pH值。粪肠球菌主要存在于人类或动物肠道，是人类和动物肠道的正常菌群等。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形，能在胆汁七叶苷琼脂上生长，不产生色素。乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角俩个平面交替形成四联状，壹般细胞成对生，单生者罕见，不成链

状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状，接触酶阴性，不产细胞色素，在不加啤酒花的麦芽汁中生长，能利用半乳糖、阿拉伯糖、木糖和海藻糖产酸，不分解蛋白质，不产吲哚，不水解马尿酸盐。某些菌株能利用蔗糖和乳糖产微量的酸。不能利用麦芽糖、甘露醇、糊精等产酸，能产丁二酮。二、检测方法

1范围

本方法规定了微生物饲料中各乳酸菌(包括干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌、戊糖片球菌)及其总数的测定及鉴定方法。

本方法适用于微生物饲料中乳酸菌的检测。

2术语：

乳酸菌：壹群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。

乳酸菌菌数总数：试料在壹定条件下培养后，所得1mL试料中所含乳酸菌菌落的总数。3设备和材料

3.1恒温培养箱：36±1℃。

3.2冰箱：0~4℃。

3.3恒温水浴：46±1℃

3.4电炉：可调式。

3.5吸管：容量为1、10、25mL。

3.6广口瓶或三角瓶：容量为500mL。

3.7平皿：直径为9cm。

3.8试管：18×180mm。

3.9显微镜。

3.10高压灭菌锅。

3.11烘箱。

4培养基和试剂

4.1改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）。

4.2改良MC培养基（ModifiedChalmers培养基）。

4.30.1%美兰牛乳培养基。

4.46.5%氯化钠肉汤。

4.5pH9.6葡萄糖肉汤。

4.640%胆汁肉汤。

4.7淀粉水解培养基。

4.8精氨酸水解培养基。

4.9乳酸杆菌糖发酵管。

4.10七叶苷培养基。

4.11革兰氏染色液。

4.123%过氧化氢溶液。

4.13蛋白胨水、靛基质试剂。

4.14明胶培养基。

4.15硝酸盐培养基、硝酸盐试剂。

4.16生理盐水：将蒸馏水加入8.5g的食盐中做成1000mL的溶液。在121℃下灭菌15min。5乳酸菌菌落总数的测定

5.1检验程序

乳酸菌菌落总数检验程序如下：

图：乳酸菌检测程序图

5.2操作步骤

5.2.1以无菌操作将经过充分摇匀的试料25mL（或25g）放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成1:10的均匀稀释液。

5.2.2用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。

5.2.3另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增壹次，即换用1支1mL灭菌吸管。

5.2.4选择2~3个之上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作俩个平皿。

5.2.5稀释液移入平皿后，应即时将冷至50℃的乳酸菌计数培养基（改良TJA或改良MC）注入平皿约15mL，且转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1mL稀释液试料用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，之上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20min内完成。

5.2.6待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃恒温培养箱内培养72±1h取出，观察乳酸菌菌落特征（见表1），选取菌落数在30~300之间的平板进行计数。

5.3乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生长形态特征见表1。