免疫组织化学
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免疫组织化学
报告人：傅琦博 指导老师：胡翊群
傅琦博 F0318102
何谓免疫组化
免疫组织化学是指在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织呈色 反应，借助可见的标记物，对相应 的抗原或抗体进行定位、定性和定 量检测的一种免疫检测方法。
傅琦博 F0318102
免疫组化的全过程
抗原的提取与 纯化
免疫动物或 细胞融合， 制备特异性 抗体及纯化
标本的固定与保存
固定的目的：是细胞内蛋白质凝固，终止胞内 酶活化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形态 与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原抗体反应 的类脂，最主要的是保存组织细胞的抗原性，在 染色和反复清洗的过程中使抗原不致释放。
好的固定剂： （1）能快速固定抗原 （2）防止抗原物质扩散 （3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应
直接法
傅琦博 F0318102
间接法
标本的处理
组织材料处理是获得良好免疫细胞组织 化学分析的保障，必须保证要检测的细胞 或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保 存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。 ❖ 标本的主要来源：活体组织、各种体液、 穿刺液、培养细胞 ❖ 标本的固定与保存 ❖ 酶消化处理
傅琦博 F0318102
常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。
2.非特异吸附法
免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异 性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相 同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物煮至上的带电 荷物质，然后再进行抗原抗体结合反应，必要时也可采用2% 左右的牛或人白蛋白封片，减少非特异性染色。
复合物； ❖ 用缓冲液冲洗去未结合的成分； ❖ 直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接
法），或待标本显色后再用显微镜观察结果 （免疫酶直接法）
傅琦博 F0318102
免疫染色
对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加 检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。
1.蛋白酶消化法
采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透 性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。
傅琦博 F0318102
荧光素
作为染料在激发光照射下能产生荧光的一类化合物
用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化 学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。 （2）阴性对照
用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴 性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和 抑制对照等，用以排除假阳性结果。
傅琦博 F0318102
免疫组化的结果判断
免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三 种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可 反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。
阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔， 而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由 显著区别。
染色 显色部位 显色定位 显色程度
特异性染色
非特异性染色
特定细胞或间质
细胞和间质均匀染色或更强
特定，具有结构性
无特定部位，无结构性
同一部位呈不同程度显色 无分布规律，某一片均匀着色
标记物与抗 体集合形成 标记抗体
显微镜下观察 结果
抗原抗体 反应和呈 色反应
标本的处 理
傅琦博 F0318102
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
组织抗原
抗体
标记物
1 荧光 2酶 3 亲和技术 4 金标
傅琦博 F0318102
标记抗体
免疫细胞化学反应原理：
＋ 组织抗原
标记抗体
傅琦博 F0318102
标记的抗原抗体复合物
两种免疫细胞化学反应方法
抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选 用的高特异性、高效价的第一抗体为多克 隆抗体。 抗体稀释的原则是阳性（抗原）物质着色 应鲜明，背景应钱或不着色。 抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏 感抗体稀释度应越高。
傅琦博 F0318102
免疫染色
免疫染色是免疫组化技术的关键步骤。 ❖ 标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体
傅琦博 F0318102
酶消化处理
石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定过程中 由于醛键形成致使某些抗原决定簇被封闭，染色不 理想，甚至出现假阴性，因而在进行免疫组化反应 之前，需要酶消化处理切片，可使抗原决定簇重新 裸露。 常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。
傅琦博 F0318102
抗体处理与保存
傅琦博 F0318102
免疫组化染色中标识物的选择
❖ 用量微小，容易在光镜或电镜下识别 ❖ 机体内无同一物质或类似物质 ❖ 物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，
其结合物也稳定
目前常用标识物质有荧光色素、放 射性同位素、重金属、微粒子、酶等
傅琦博 F0318102
设立对照实验
为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通 常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对 照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。 （1）阳性对照
傅琦博 F0318102
几种常用的免疫组化检测技术
❖ 荧光免疫组织化学技术 ❖ 酶免疫组织化学技术 ❖ 免疫金（银）组织化学技术 ❖ 免疫标记电镜技术 ❖ ……
傅琦博 F0318102
免疫荧光技术 免疫荧光技术将 荧光素作为标记物 使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显 微镜下可见，从而显示抗原物质的定位
傅琦博 F0318102
标本的固定与保存
冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中最常用的 制片方法。
冰冻切片制片方法简单，可避免石蜡切片因 固定、脱水、浸蜡等步骤造成的抗原损失。迅 速冷冻可防止冰晶的形成，避免组织细胞结构 的破坏。
石蜡切片是观察组织细胞结构的理想方法， 可用于陈旧石蜡包埋材料的回顾性免疫组化研 究，切片薄，有连续性，蜡块可长期保存，但 是抗原的保存量不如冰冻切片。
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标本的固定与保存
抗原
各种抗原的固定
固定剂
固定温度与时间
蛋白质 免疫球蛋白 酶 激素 细菌 病毒
类脂质 细胞悬液
95％乙醇 丙酮 四氯化磺 1％聚甲醛 丙酮、甲醇 丙酮，无水乙醇 四氯化磺 10％甲醛 1％聚甲醛
室温，3～15min 4℃，30min 4 ℃ ，30min 4 ℃ ，4～5h 室温，3～10min 室温，5～10min 4 ℃ ，30～60min 室温，3～10min 室温，2min
报告人：傅琦博 指导老师：胡翊群
傅琦博 F0318102
何谓免疫组化
免疫组织化学是指在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织呈色 反应，借助可见的标记物，对相应 的抗原或抗体进行定位、定性和定 量检测的一种免疫检测方法。
傅琦博 F0318102
免疫组化的全过程
抗原的提取与 纯化
免疫动物或 细胞融合， 制备特异性 抗体及纯化
标本的固定与保存
固定的目的：是细胞内蛋白质凝固，终止胞内 酶活化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形态 与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原抗体反应 的类脂，最主要的是保存组织细胞的抗原性，在 染色和反复清洗的过程中使抗原不致释放。
好的固定剂： （1）能快速固定抗原 （2）防止抗原物质扩散 （3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应
直接法
傅琦博 F0318102
间接法
标本的处理
组织材料处理是获得良好免疫细胞组织 化学分析的保障，必须保证要检测的细胞 或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保 存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。 ❖ 标本的主要来源：活体组织、各种体液、 穿刺液、培养细胞 ❖ 标本的固定与保存 ❖ 酶消化处理
傅琦博 F0318102
常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。
2.非特异吸附法
免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异 性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相 同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物煮至上的带电 荷物质，然后再进行抗原抗体结合反应，必要时也可采用2% 左右的牛或人白蛋白封片，减少非特异性染色。
复合物； ❖ 用缓冲液冲洗去未结合的成分； ❖ 直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接
法），或待标本显色后再用显微镜观察结果 （免疫酶直接法）
傅琦博 F0318102
免疫染色
对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加 检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。
1.蛋白酶消化法
采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透 性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。
傅琦博 F0318102
荧光素
作为染料在激发光照射下能产生荧光的一类化合物
用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化 学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。 （2）阴性对照
用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴 性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和 抑制对照等，用以排除假阳性结果。
傅琦博 F0318102
免疫组化的结果判断
免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三 种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可 反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。
阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔， 而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由 显著区别。
染色 显色部位 显色定位 显色程度
特异性染色
非特异性染色
特定细胞或间质
细胞和间质均匀染色或更强
特定，具有结构性
无特定部位，无结构性
同一部位呈不同程度显色 无分布规律，某一片均匀着色
标记物与抗 体集合形成 标记抗体
显微镜下观察 结果
抗原抗体 反应和呈 色反应
标本的处 理
傅琦博 F0318102
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
组织抗原
抗体
标记物
1 荧光 2酶 3 亲和技术 4 金标
傅琦博 F0318102
标记抗体
免疫细胞化学反应原理：
＋ 组织抗原
标记抗体
傅琦博 F0318102
标记的抗原抗体复合物
两种免疫细胞化学反应方法
抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选 用的高特异性、高效价的第一抗体为多克 隆抗体。 抗体稀释的原则是阳性（抗原）物质着色 应鲜明，背景应钱或不着色。 抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏 感抗体稀释度应越高。
傅琦博 F0318102
免疫染色
免疫染色是免疫组化技术的关键步骤。 ❖ 标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体
傅琦博 F0318102
酶消化处理
石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定过程中 由于醛键形成致使某些抗原决定簇被封闭，染色不 理想，甚至出现假阴性，因而在进行免疫组化反应 之前，需要酶消化处理切片，可使抗原决定簇重新 裸露。 常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。
傅琦博 F0318102
抗体处理与保存
傅琦博 F0318102
免疫组化染色中标识物的选择
❖ 用量微小，容易在光镜或电镜下识别 ❖ 机体内无同一物质或类似物质 ❖ 物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，
其结合物也稳定
目前常用标识物质有荧光色素、放 射性同位素、重金属、微粒子、酶等
傅琦博 F0318102
设立对照实验
为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通 常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对 照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。 （1）阳性对照
傅琦博 F0318102
几种常用的免疫组化检测技术
❖ 荧光免疫组织化学技术 ❖ 酶免疫组织化学技术 ❖ 免疫金（银）组织化学技术 ❖ 免疫标记电镜技术 ❖ ……
傅琦博 F0318102
免疫荧光技术 免疫荧光技术将 荧光素作为标记物 使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显 微镜下可见，从而显示抗原物质的定位
傅琦博 F0318102
标本的固定与保存
冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中最常用的 制片方法。
冰冻切片制片方法简单，可避免石蜡切片因 固定、脱水、浸蜡等步骤造成的抗原损失。迅 速冷冻可防止冰晶的形成，避免组织细胞结构 的破坏。
石蜡切片是观察组织细胞结构的理想方法， 可用于陈旧石蜡包埋材料的回顾性免疫组化研 究，切片薄，有连续性，蜡块可长期保存，但 是抗原的保存量不如冰冻切片。
傅琦博 F0318102
标本的固定与保存
抗原
各种抗原的固定
固定剂
固定温度与时间
蛋白质 免疫球蛋白 酶 激素 细菌 病毒
类脂质 细胞悬液
95％乙醇 丙酮 四氯化磺 1％聚甲醛 丙酮、甲醇 丙酮，无水乙醇 四氯化磺 10％甲醛 1％聚甲醛
室温，3～15min 4℃，30min 4 ℃ ，30min 4 ℃ ，4～5h 室温，3～10min 室温，5～10min 4 ℃ ，30～60min 室温，3～10min 室温，2min