荧光素FITC标记抗体的方法

荧光素FITC标记抗体的方法当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。

一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→FITC-NS-C-N-H2-蛋白质
常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。

1．Marsshall法
(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光
素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或
3．0的0．01mol／LPBS等。

(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于使最后免疫球蛋白浓度为再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，烧杯中，
20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。

②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。

也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出
需加缓冲液的量。

a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。

b．总蛋白量(AXB)＝Crag。

c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。

d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。

e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。

f．PBS量D-(B+F)=Gml。

注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白
总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓。

ml的容积，PBS为G；ml冲液的容积，
③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，
继续避光搅拌12h左右。

结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。

④透析结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8．0缓冲盐水透析(0～4~C)过夜。

⑤过柱取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。

洗脱液：0．01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．2)；过滤量：12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析)；收集量：20ml(稀释1．7倍左右)。

2．Chadwick法
(1)试剂和材料抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0．01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯（25ml）搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）透析袋等。

(2)方法及步骤①抗体准备用o～4~C的pH8。

0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg／ml，置入25ml烧杯内，放于冰槽中。

．
②荧光色素准备按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0．01rug计算，称取所需的荧光素，用3％碳酸钠水溶液溶解。

③将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在o～4~C 冰箱中结合(最好在磁力搅拌机上持续搅拌)18～24h。

④透析和柱层析方法同Marsshall法。

3．改良法
(1)试剂和材料①0．01mol／L(pH7．2)PBS配法中，校定pH至
7．2。

NaCi 18g、Na2HP04 1．15g，溶于2000ml蒸馏水
②0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液配法取0．5mol／LNazCOs(5．3％)10ml加入0．5mol／LNaHC03(4．2％)90ml，混合后，校定pH至9．0。

③3％碳酸钠水溶液配法称L 5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。

④其他试剂和材料l％叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、
搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等。

(2)方法及步骤①取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(0．15mol／LNaCl)及缓冲液(0．5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9．0)稀释使每毫升内含蛋白质lOmg，缓冲液为总量的10％，降温至4℃。

②加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素[蛋白：荧光素＝(50—80)mg‘lmg]，在0～4℃。

12～14h下电磁搅拌③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白
沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。

④将制备好的荧光抗体加叠氮化钠o．01％，分装在lml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，一20~C保存可达2
年以上。

．透析标记法4
此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。

(1)试剂和材料试剂和材料同改良法。

(2)方法及步骤①用0．025mol／L碳酸盐缓冲液pH9．0，将欲标记免疫球蛋白稀释成1％浓度，装入透析袋中。

②用同一缓冲液将FITC配成0．1mg／ml的溶液，按10mg／ml 球蛋白溶液体积的10倍，将FITC稀释液盛于圆柱形容器内，并液中。

FITC使透析袋浸没于
③容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4~C电磁搅拌下透析标记24h。

取出透析袋中标记液，即刻用SephadexG50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装，贮存于4℃中。

FITCCAS#：3326-32-7中文名：异硫氰酸荧光素
英文名：Flourescein iso-thiocyanate；FITC
结构式：
分子式：CHNOS 51121：389.38分子量：性质 1. 外观：黄色粉末2. 纯度：≥95% (HPLC)3. 产品描述：
FITC能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光。

通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。

用于医学，农学和畜牧等方面，可对由地细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。

标记抗体流程：4. FITC（1）将待交联的蛋白（浓度≥1mg/mL）对交联反应液透析三次4 ℃，至pH＝9.0。

交联反应液配制方法：7.56g NaHCO，1.06g NaCO，3237.36g NaCl，加水定容至1 L。

（2）将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/mL。

每次交联使用的FITC 均应新鲜配制，避光。

（3）按P:F（蛋白质:FITC）=1mg:150μg 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 ℃反应8 h。

（4）加入5mol/L的NHCl至终浓度50mmol/L，4 ℃终止反应2 4。

h
（5）将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。

（6）交联物的鉴定
–0.31×A ] / 1.4 [ 蛋白浓度(mg/mL) = A495280F/P比例: 3.1×A / [A –0.31×A ]，该值应介于2.5 ~ 6.5之495280495间。

（7）FITC交联的蛋白应置于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1% NaN、1% BSA，4℃避光保存。

3℃避光保存：储存条件4。