降低斑马鱼cntnap2表达建立注意缺陷多动障碍遗传模型

摘要目的通过降低斑马鱼接触蛋白相关蛋白基因2（contact protein-related protein gene 2, cntnap2）表达，建立注意缺陷多动障碍（attention-deficit/hyperactivity disorder，ADHD）遗传模型。

方法以注射剪接抑制型吗啉代寡聚核糖核酸降低cntnap2表达的斑马鱼作为实验组（n=48），注射随机寡核苷酸片段的斑马鱼作为对照组（n=48)，通过原位杂交观察斑马鱼神经递质系统相关基因th、dbh、gad1b、glyt2、vglut2表达的变化，使用实时荧光定量PCR检测神经递质系统及神经元发育相关基因表达量变化。

使用斑马鱼行为轨迹跟踪系统记录（Noldus行为仪）检测cntnap2表达降低后多动/冲动行为及托莫西汀对多动/冲动行为的改善作用。

结果原位杂交实验结果显示实验组较对照组神经递质系统相关基因dbh表达减少，gad1b表达增加；th、glyt2、vglut2表达未见明显差异。

实时荧光定量PCR显示实验组较对照组神经递质系统相关基因dbh表达降低（t=5.772，P=0.005），snap25、dat、gad1b表达增高（t=14.310、22.210、22.090,均P<0.01）；神经元发育相关基因shha、epha4b、netrin1b、noi及神经递质系统相关基因drd4、th、vglut2、glyt2表达差异均无统计学意义。

6 dpf时药物未处理实验组较药物未处理对照组幼鱼游动总距离长［143.12(98.56, 212.22) cm 与99.03(80.54, 133.96) cm，Z=-3.547，P<0.01］，平均游动速度快［0.050(0.041, 0.067) cm/s与0.033(0.025, 0.042) cm/s, Z=-5.495，P<0.01］；经托莫西汀处理后，实验组药物处理较药物未处理幼鱼游动总距离减少［106.59(95.28, 120.10) cm与143.12(98.56, 212.22) cm, Z=-3.591，P<0.01］，平均游动速度减慢［0.031(0.028, 0.037) cm/s与0.050(0.041, 0.067) cm/s，Z=-7.035，P<0.01］。

结论cntnap2表达降低斑马鱼可通过改变dbh、snap25、dat、gad1b表达量而产生多动/冲动表型，托莫西汀可有效缓解多动/冲动表型，cntnap2表达降低斑马鱼可作为ADHD遗传模型。

注意缺陷多动障碍（attention-deficit/hyperactivity disorder，ADHD）是临床上最常见的一种神经发育障碍性疾病，主要表现为与年龄不相符的注意力不集中、多动、冲动，并且可持续终生。

通过Meta分析显示全球5%的儿童受该病困扰。

ADHD平均遗传度为0.76［1］。

Mooney等［2］对来自精神疾病基因组联盟的2个ADHD GWAS数据进行通路分析，其结果支持神经递质释放调节、神经突生长和轴突导向与ADHD相关的假说。

研究提示ADHD发病与遗传相关，发病机制与神经系统发育、神经递质系统相关。

我们课题组在ADHD患者中通过GWAS分析发现接触蛋白相关蛋白基因2 （contactin-associated protein-like 2,CNTNAP2）为ADHD的候选基因［3］。

Elia等［4］报道CNTNAP2基因与ADHD相关。

CNTNAP2基因纯合突变的儿童具有多动、冲动的行为表型［5］。

Bisgaard等［6］研究发现一对双胞胎儿童的7号染色体长臂3区4带至3区6带2亚带缺失，伴有严重的注意缺陷和多动，而CNTNAP2基因就位于该区段。

以上研究提示CNTNAP2基因功能异常可能出现ADHD症状。

CNTNAP2基因含有25个外显子，编码轴突蛋白相关细胞黏附分子，即CNTNAP2蛋白或CASPR2蛋白，是轴突蛋白超家族的一员，在脊椎动物神经系统中具有细胞黏附分子及受体的功能。

人脑发育时CNTNAP2信使RNA（mRNA）显著富集于额叶、颞叶，成年时大脑中纹状体回路及额叶皮质也显著富集［7］。

1项MRI研究显示，CNTNAP2基因的变异与额叶灰质减小及功能连接改变相关［8］。

以上研究提示CNTNAP2基因可能参与神经系统的发育。

斑马鱼的脑和脊髓与人类相应神经解剖结构高度保守，并且约70%的基因与人类同源，因此是良好的实验动物。

既往研究显示在小鼠中敲除该基因出现多动/冲动表型［9］，而引起多动/冲动表型的机制有待进一步研究，本研究中我们拟在斑马鱼受精卵阶段降低cntnap2基因表达，探讨其功能缺陷对斑马鱼胚胎发育神经系统基因表达和幼鱼行为的影响，尝试建立ADHD的遗传模型。

材料和方法一、材料本研究起止时间为2017年7月至2019年7月。

1.实验动物：以Tubingen(Tu）品系斑马鱼作为野生型（wild type, WT），由北京大学生命科学学院中心鱼房提供。

饲养条件：光周期为14 h光照/10 h黑暗交替，水温28.5 ℃。

于晚餐饲喂完毕后配鱼，雌雄比为1∶1或2∶1。

将鱼卵收集到培养皿中，用吸管挑去死卵、粪便等，更换为幼鱼培养液E2（1 mmol/L氯化钙、0.5 mmol/L氯化钾、0.15 mmol/L 磷酸二氢钾、0.05 mmol/L磷酸氢二钠、0.7 mmol/L碳酸氢钠、15 mmol/L氯化钠和1 mmol/L硫酸镁），将鱼卵置于恒温培养箱（28.5 ℃）中培养。

每天观察胚胎的发育情况，挑除死卵、未受精卵、卵膜碎片以及发育畸形的胚胎，并换幼鱼培养液，以避免霉菌滋生而致其他正常胚胎死亡。

用受精后天数（day pose-fertilization, dpf）描述幼鱼的时期。

未进行注射的斑马鱼作为野生型组，以注射cntnap2基因剪接抑制型吗啡啉反义寡核苷酸降低cntnap2表达的斑马鱼作为实验组，以注射随机吗啡啉反义寡核苷酸的斑马鱼作为对照组。

2.药品及试剂：cntnap2基因剪接抑制型吗啡啉反义寡核苷酸，序列为：5′-AGCACCTACAGA AACAGCACCATAC-3′，作用于位点内含子1/外显子2，随机吗啡啉反义寡核苷酸为对照，注射浓度：0.5 nmol/L，注射量为1 nL (Gene Tools公司, 美国)；TrizonRNA提取试剂盒（Invitrogen公司, 美国）和cDNA第一链合成试剂盒（Promega公司，美国)，SYBR® Green SuperMix-UDG定量PCR试剂盒（Invitrogen公司，美国)，RNA纯化试剂盒（QIAGEN公司，德国)，T3/T7/SP6 RNA聚合酶（Promega公司，美国)，NBT/BCIP底物显色剂（Promega公司，美国)，抗DIG AP-Conjugate 抗体（Roche公司, 中国)；托莫西汀（Tocris公司，英国）。

本研究已获得南方科技大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会的审核批准，伦理批号：SUSTC-JY2019089。

二、方法tnap2基因剪接抑制吗啡啉反义寡核苷酸效用检测：在斑马鱼胚胎单胞期实验组注射cntnap2基因剪接抑制吗啡啉反义寡核苷酸、对照组注射随机吗啡啉反义寡核苷酸，待发育到3 dpf时收集幼鱼提取RNA，反转录cDNA，进行PCR（引物序列为：cntnap2-F：5′-AGCTATGTTCCAGGATACGCC-3′，cntnap2-R：5′-CAAATAACGGGCCACAACCG-3′；β-actin-F：5′-CGAGCTGTCTTCCCATCCA-3′，β-actin-R：5′-TCA- CCAACGTAGCTGTCTTTCTG-3′），为了进一步明确cntnap2基因剪接抑制吗啡啉反义寡核苷酸敲低cntnap2基因表达量是通过内含子1保留还是外显子2缺失，从而设计Primer1和Primer2，Primer1位于外显子1和内含子1，引物序列为：F：5′-AGCTATGTTCCAGGA- TACGCC-3′，R：5′-GAGTGTACGGTTTTGCTAAC-3′；Primer2位于外显子1和外显子2，引物序列为：F：5′-TGTGATGAAGCTCTGGTC-3′，R：CCAGATGTTGCC- ATCTTG-3′进行验证；Primer3为β-actin，序列同前。

2.原位杂交实验：根据Ensembl（斑马鱼zv9）数据库提供的基因组信息及文献报道，设计合适的引物，克隆基因片段并测序正确后，将正确的片段连接到Ez-T载体（GeneStar公司）上。

构建好载体后，通过测序确定连接方向，然后选择合适的内切酶线性化该载体，最后进行体外合成RNA探针。

利用th、dbh、gad1b、glyt2、vglut2 RNA探针标记儿茶酚胺类神经元、去甲肾上腺素能神经元、γ-氨基丁酸能神经元、甘氨酸能神经元、谷氨酸能神经元，通过原位杂交实验观察这些神经元的变化。

合成RNA探针的引物序列见表1。

在发育到受精后10 h（hour pose-fertilization, hpf）时加入1-苯基-2硫脲（1-Propyl-2-thioura, PTU)，抑制色素生长，分别收集1 dpf、2 dpf、3 dpf、4 dpf胚胎，用4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定，然后进行原位杂交，具体实验方法参见文献［10］。

原位杂交实验后图像采集：将原位杂交的胚胎放入滴有70%的甘油或2.5%的甲基纤维素的凹槽载玻片上，按照一定体位摆好，使用蔡司Z1显微镜采集图像，放大倍数为目镜10倍，物镜20倍。

3.实时荧光定量PCR：分别收集1 dpf、3 dpf幼鱼，提取RNA，反转录cDNA，然后进行实时荧光定量PCR检测，引物序列见表2。

4.行为及药物实验：在斑马鱼胚胎单细胞期分别注射cntnap2基因剪接抑制吗啡啉反义寡核苷酸和随机吗啡啉反义寡核苷酸。

待生长到6 dpf时，将幼鱼置于48孔板，放入Noldus行为仪，记录运动轨迹；首先让幼鱼在行为仪中适应10 min，然后开始记录，记录1 h内的游动数据；行为仪提供28.5 ℃恒温环境。

将实验组与对照组各分为药物处理和药物未处理2种情况，药物处理的方法为将幼鱼置于含有5 μmol/L托莫西汀（购自Tocris公司）的E2溶液中1 h，托莫西汀的E2溶液现用现配；使用Noldus EthoVision XT进行运动轨迹行为分析，观测药物处理与未处理幼鱼游动距离和游动速度。

5.统计学处理：数据使用SPSS 22.0进行分析，基因表达量根据每个基因CT值，采用2-ΔΔCT计算变化倍数，以x¯±s表示，采用独立样本t检验进行组间比较。