降低斑马鱼cntnap2表达建立注意缺陷多动障碍遗传模型

摘要目的

通过降低斑马鱼接触蛋白相关蛋白基因2（contact protein-related protein gene 2, cntnap2）表达，建立注意缺陷多动障碍（attention-deficit/hyperactivity disorder，ADHD）遗传模型。

方法

以注射剪接抑制型吗啉代寡聚核糖核酸降低cntnap2表达的斑马鱼作为实验组（n=48），注射随机寡核苷酸片段的斑马鱼作为对照组（n=48)，通过原位杂交观察斑马鱼神经递质系统相关基因th、dbh、gad1b、glyt2、vglut2表达的变化，使用实时荧光定量PCR检测神经递质系统及神经元发育相关基因表达量变化。使用斑马鱼行为轨迹跟踪系统记录（Noldus行为仪）检测cntnap2表达降低后多动/冲动行为及托莫西汀对多动/冲动行为的改善作用。

结果

原位杂交实验结果显示实验组较对照组神经递质系统相关基因dbh表达减少，gad1b表达增加；th、glyt2、vglut2表达未见明显差异。实时荧光定量PCR显示实验组较对照组神经递质系统相关基因dbh表达降低（t=5.772，P=0.005），snap25、dat、gad1b表达增高（t=14.310、22.210、22.090,均P<0.01）；神经元发育相关基因shha、epha4b、netrin1b、noi及神经递质系统相关基因drd4、th、vglut2、glyt2表达差异均无统计学意义。6 dpf时药物未处理实验组较药物未处理对照组幼鱼游动总距离长［143.12(98.56, 212.22) cm 与99.03(80.54, 133.96) cm，Z=-3.547，P<0.01］，平均游动速度快［0.050(0.041, 0.067) cm/s与0.033(0.025, 0.042) cm/s, Z=-5.495，P<0.01］；经托莫西汀处理后，实验组药物处理较药物未处理幼鱼游动总距离减少［106.59(95.28, 120.10) cm与143.12(98.56, 212.22) cm, Z=-3.591，P<0.01］，平均游动速度减慢［0.031(0.028, 0.037) cm/s与0.050(0.041, 0.067) cm/s，Z=-7.035，P<0.01］。

结论

cntnap2表达降低斑马鱼可通过改变dbh、snap25、dat、gad1b表达量而产生多动/冲动表型，托莫西汀可有效缓解多动/冲动表型，cntnap2表达降低斑马鱼可作为ADHD遗传模型。

注意缺陷多动障碍（attention-deficit/hyperactivity disorder，ADHD）是临床上最常见的一种神经发育障碍性疾病，主要表现为与年龄不相符的注意力不集中、多动、冲动，并且可持续终生。通过Meta分析显示全球5%的儿童受该病困扰。ADHD平均遗传度为0.76［1］。Mooney等［2］对来自精神疾病基因组联盟的2个ADHD GWAS数据进行通路分析，其结果支持神经递质释放调节、神经突生长和轴突导向与ADHD相关的假说。研究提示ADHD发病与遗传相关，发病机制与神经系统发育、神经递质系统相关。我们课题组在ADHD患者中通过GWAS分析发现接触蛋白相关蛋白基因2 （contactin-associated protein-like 2,CNTNAP2）为ADHD的候选基因［3］。Elia等［4］报道CNTNAP2基因与ADHD相关。CNTNAP2基因纯合突变的儿童具有多动、冲动的行为表型［5］。Bisgaard等［6］研究发现一对双胞胎儿童的7号染色体长臂3区4带至3区6带2亚带缺失，伴有严重的注意缺陷和多动，而CNTNAP2基因就位于该区段。以上研究提示CNTNAP2基因功能异常可能出现ADHD症状。

CNTNAP2基因含有25个外显子，编码轴突蛋白相关细胞黏附分子，即CNTNAP2蛋白或CASPR2蛋白，是轴突蛋白超家族的一员，在脊椎动物神经系统中具有细胞黏附分子及受体的功能。人脑发育时CNTNAP2信使RNA（mRNA）显著富集于额叶、颞叶，成年时大脑中纹状体回路及额叶皮质也显著富集［7］。1项MRI研究显示，CNTNAP2基因的变异与额叶灰质减小及功能连接改变相关［8］。以上研究提示CNTNAP2基因可能参与神经系统的发育。斑马鱼的脑和脊髓与人类相应神经解剖结构高度保守，并且约70%的基因与人类同源，因此

是良好的实验动物。既往研究显示在小鼠中敲除该基因出现多动/冲动表型［9］，而引起多动/冲动表型的机制有待进一步研究，本研究中我们拟在斑马鱼受精卵阶段降低cntnap2基因表达，探讨其功能缺陷对斑马鱼胚胎发育神经系统基因表达和幼鱼行为的影响，尝试建立ADHD的遗传模型。

材料和方法

一、材料

本研究起止时间为2017年7月至2019年7月。

1.实验动物：以Tubingen(Tu）品系斑马鱼作为野生型（wild type, WT），由北京大学生命科学学院中心鱼房提供。饲养条件：光周期为14 h光照/10 h黑暗交替，水温28.5 ℃。于晚餐饲喂完毕后配鱼，雌雄比为1∶1或2∶1。将鱼卵收集到培养皿中，用吸管挑去死卵、粪便等，更换为幼鱼培养液E2（1 mmol/L氯化钙、0.5 mmol/L氯化钾、0.15 mmol/L 磷酸二氢钾、0.05 mmol/L磷酸氢二钠、0.7 mmol/L碳酸氢钠、15 mmol/L氯化钠和1 mmol/L硫酸镁），将鱼卵置于恒温培养箱（28.5 ℃）中培养。每天观察胚胎的发育情况，挑除死卵、未受精卵、卵膜碎片以及发育畸形的胚胎，并换幼鱼培养液，以避免霉菌滋生而致其他正常胚胎死亡。用受精后天数（day pose-fertilization, dpf）描述幼鱼的时期。未进行注射的斑马鱼作为野生型组，以注射cntnap2基因剪接抑制型吗啡啉反义寡核苷酸降低cntnap2表达的斑马鱼作为实验组，以注射随机吗啡啉反义寡核苷酸的斑马鱼作为对照组。

2.药品及试剂：cntnap2基因剪接抑制型吗啡啉反义寡核苷酸，序列为：5′-AGCACCTACAGA AACAGCACCATAC-3′，作用于位点内含子1/外显子2，随机吗啡啉反义寡核苷酸为对照，注射浓度：0.5 nmol/L，注射量为1 nL (Gene Tools公司, 美国)；Trizon