4种重金属对发光菌的急性毒性和联合毒性研究[开题报告]

毕业论文开题报告环境工程4种重金属对发光菌的急性毒性和联合毒性研究一、选题的背景、意义随着工业农业的发展，大量污染物进入环境。

而重金属对环境的影响是巨大的，会对生态系统和人类健康产生潜在的长远的危害[1]，当然对重金属进行研究与毒性的测定也是刻不容缓的事。

并且，有环境危险因素对生态系统和人类健康的有害效应并不是单一污染物作用的结果，而是各种污染物混合作用的结果。

待测生物暴露在混合污染物中时，由于混合物中各组分相互影响，会产生联合毒性[2]作用，表现为加和作用、协同作用和拮抗作用[3-4]。

（一）首先，要保护环境，其中第一步就是正确监测环境污染的情况。

目前主要是用物理仪器和化学分析相结合的方法。

这类方法的优点是能准确定性和定量，但是其仪器设备往往价格昂贵，技术要求和使用成本很高，只能在实验室里使用，即使不考虑这些仪器的昂贵价格及其他不便因素，仍然有一个重要问题：这样的毒物泄露到底对人类的健康有多大危害？尤其是中，远期危害，上述检验是无法直接回答这个问题的。

要回答对人群健康的影响，即对生物毒性大小的判断，必须用生物医学的方法对污染的生物毒性进行分析。

目前较常用的是检测污染物毒性的方法是从医学物理学的方法引用过来的小鼠，鱼，或藻类毒性实验，但其有不可克服的缺点，如时间长，要有专门的人员操作，成本大，个体存在差异等。

而应用发光细菌来检测污染物毒性则能克服这些缺点，具有方便、灵敏、高效进行等优点而被广泛应用[5-6]，化合物对发光菌的毒性与对其它生物的毒性数据有一定的相关性[7]在有毒物质的筛选和环境污染物的生态风险评价等方面具有重要意义[8]。

而淡水发光菌-青海弧菌[9]，和海洋型发光菌不同，具有更优越的性质，其不要Na存在有能生长发光良好，并且，新鲜培养的青海弧菌能在蒸馏水里能良好发光，且稳定发光课持续30min以上，因此，在淡水样品的检测中可以用蒸馏水做空白对照。

而淡水样品也不需要做任何额外添加物，直接将青海弧菌加进去就行了。

此外，该细菌对环境的pH有较宽的适应范围，因而一般不需要对样品的pH做调整即可检验。

（二）其次，对于4种重金属[10]对发光菌的急性毒性和联合毒性研究在方法的选取上，使用单位毒性法，Tu法是以浓度相加为基础模式，判别方法简单，是最早研究联合毒性的方法，方法较为成熟。

在判别相加作用时具有较好的可靠性，曾得到较为广泛的应用。

Tu 法还可判断有机混合物联合毒性的强弱。

（三）四种重金属的选择:水中金属毒物汞，镉，铜，锌对人体健康危害较大，可以对人体造成急性中毒。

所以选择以上四种重金属做为研究对象二、相关研究的最新成果及动态（一）我国发光菌研究概况20世纪50时年代，在我国首次有人做了相关研究。

山东大学的薛庭耀教授对我国的发光菌做了报道，之后其又陆续对发光菌的生理做了相关研究，因此薛庭耀教授可能是我国最先对我国的发光菌做出研究的人。

之后20世纪70年代华东师范大学的生物系的杨颐康教授和叶履平副教授开展了对我国发光菌的研究，从海洋生物中分离了10个发光菌细菌菌株。

在20世纪80年代，华东师范大学发光菌研究组从我国海域上分离得到上千发光细菌，经分别鉴定有六个种。

值得一提的事，在青海省发现了发光细菌，经五年详细的坚定之后，发现了一个新的菌种，而且不需要NaCl就能生长和发光，是一种罕见的淡水型发光细菌，就是青海弧菌，还有相关很多学者对此进行研究，对发光菌的研究取得了很大的进展。

纵观近10年来关于发光菌的研究，国内大部分已转向应用方面，尤其是在环境毒物的检测上，这方面的论文每年都发表很多，数量很多，最近也有将发光菌应用于食品安全方面。

（二）发光菌检测法的应用由于L . B .T 技术具有应用范围广，灵敏度高、相关性好，反应速度快等优点，因而被广泛应用在环境监测中。

吴自荣等利用L.B.T技术快速分析大气污染，发现汽车尾气、香烟烟雾、氨气等对细菌发光有不同程度的抑制作用，时间效应、剂量效应明显。

Winger等对美国乔治亚州抓碱厂污染土坡进行L.B.T技术分析发现，其中主要毒性来自甲基汞和多抓联苯。

顾宗镰的研究表明随着离排污口距离不断增加，津杭运河水中污染物毒性下降，发光细菌的发光程度随之恢复。

Thomulk等对水源中20余种化合物进行毒性分析，表明明亮发光杆菌是水中低浓度有机毒物的有效指示生物。

L. B. T 技术除了在空气、土壤、水的监测中发挥重要的作用外，还被用于其它污染物的分析。

Yates等利用L.B .T 技术对黄曲祥毒素B,、桔霉素等8种毒素测得的毒性次序与哺乳动物细胞毒性试验结果一致。

Mantel等应用Co及X射线照射明亮发光杆菌，发现细菌发光强度随照射时间的延长、照射强度的增加而下降，提出将发光细菌作为一种衡量放射性生物效应的指示生物。

（三）混合污染物联合毒性研究混合污染物联合毒性研究始于1939[11年，经过近70年的发展，已经成功发展了Tu[12] (毒性单位)法AI(加和指数)法[13]、MTI(混合毒性指数)法[14]及入(相似参数)法[15]。

这些方法都能根据实验和相应公式的计算结果简单判别混合物的联合作用方式为拮抗、独立、相加及协同。

然而，随着新化学品的不断问世及联合毒性的复杂性和多变性，越来越多科学研究者发现这些方法只能定性判断污染物的联合作用方式，并不能判断其作用的程度，因此，他们呼吁联合毒性的研究必须进入到定量研究阶段。

从20世纪90年代始，混合污染物联合毒性研究有了一定的进展，先后提出以Tu和入为参数的定量研究方法和混合化合物的定量结构一活性相关M—QSAR[15]法，初步建立了M—QSAR的理论框架，但如何建立一套能有效定量预测混合物的毒性目前还一直是国内外研究的焦点三、课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标（一）发光菌的发光机理细菌发光是在发光酶(Luciferase)的催化下由氧将长链脂肪醛氧化成脂肪酸，还原型黄素单核苷酸氧化成脱氢型黄素单核苷酸，同时将化学反应中的一部分能量以光的形式释放出来，光辐射的强度与酶的含量及底物的浓度呈正比，可简单概述为以下模式FMN H2 + O2 + RCHO 细菌荧光酶RCOOH + FMN + H2O + hν（二）研究方法早在1939年，Bliss在“毒物联合使用的毒性”一文中最早提到化学毒物之间存在“拮抗、独立、相加和协同四类作用”。

这也是一直以来较为公认和普遍采用的术语。

目前，判别这四类联合作用的毒性指标主要有毒性单位(TU)、加和指数(AJ)、混合毒性指数(MTI)和相似参数(入)等。

本实验选取毒性单位法毒性单位法（Toxic Unit）毒性单位（TU）这一概念最早由Sprague和Ramsay于1965年提出，他们在研究铜锌混合物对大马哈幼鱼的联合毒性时首次用毒性单位来表示化合物的浓度。

1975年，Marking 和Dawson[10]将这一概念推广到混合物的相加作用。

规定：TU=Ci/IC 50i 其中： Ci 是混合物中i 组分的浓度，IC50i 是珠峰的IC50值。

对于一个n 组分的混合物来说n n ni i IC C IC C IC C TU M 50...502215011+++==∑= M0=M/(TUi)max 根据各组分毒性单位之和M 值来评价混合物的作用类型。

式(1)中，Ci 为化合物i 的浓度；IC 50i 为化合物i 的IC50或LC50埘。

运用此公式对混合物联合作用的判断标准为：若M =1(定义TU=ΣTUi)，那么化学物之间呈相加作用；若M>Mo,学物之间呈拮抗作用；若M<I ，化学物之间呈协同作用；若M=Mo ，化学物之间为独立作用；若Mo>M>1，化学物之间呈部分加和作用。

（三）实验1.实验目的：利用淡水发光菌Q67发光值的测定方法，采用联合毒性单位法，在测定几种重金属单一毒性EC50的基础上，对重金属二元混合物的联合毒性进行评价。

2.实验材料(1).菌种青海弧菌Q67(2.)培养液KH 2P04 13.6mg ，Na 2HP04·12H 2O 35.8mg ，MgS04·7H 20 0.25g ，MgCl 2·6H 2O 0.61g ，CaCl 2 33.0mg ，NaCl 1.5g ，酵母浸出液 5.0g ，胰蛋白胨 5.0g ，甘油 3.0g ，溶于1000mL 蒸馏水。

(3).培养基培养液（按上述配方） 1000mL琼酯粉 16gPH 7.0±0.5(4).菌种的培养将装有冻干粉的安培瓶先置于4℃冰箱内约10～15min ，在超净工作台中切开安培瓶，取已灭菌的蒸馏水100uL点在培养皿平板上，用接种针取一环菌种蘸去点的溶液在平板上划线，倒置放于恒温培养箱中于22℃培养24h；挑取单个菌落接种于斜面培养基上，于22℃培养24小时候后转接于斜面，将培养好的第3代斜面置4℃冰箱备用；将培养好的菌种接种到50mL液体培养基中，22℃振荡培养16～24h，待用。

重金属盐（盐酸盐），分析纯2.实验方案分单因子，双因子实验，双因子实验以二二自由组合，以及极差R来衡量他们在这一体系中共存时对发光细菌发光大小的影响。

3.测试方法（1）单一毒性的测定方法将待测金属的盐酸盐分别用蒸馏水配成0.1％~1％德溶液浓度备用，以重金属的重量计算溶液浓度。

用发光菌菌液4ml,加入1ml不同浓度的重金属离子溶液，对照以1ml蒸馏水水取代重金属离子溶液，充分混匀，每种不同浓度的重金属离子溶液设2组平行。

10min时用生物毒性测试仪测定发光强度。

用直线内插法求出相对发光率为50％时所对应的化合物质量浓度，即为该种化合物对发光菌半数发光抑制质量浓度EC50。

每组质量浓度梯度设2个平行实验，标准偏差低于10％。

（2）联合毒性测定根据单一毒性试验结果，将四种重金属按毒性比1∶1设置联合毒性试验的质量浓度梯度，各混合体系的EC50。

测定方法与单一体系相同。

每组质量浓度梯度设2个平行实验，标准偏差不超过10％。

溶液的配制采用等毒性混合的方法，即混合物中各组分的毒性比(TR)等于l，每种混合物设置5个质量浓度组，l组空白对照（蒸馏水），每组2个平行样本。

四．论文详细工作进度和安排2010.11．20—2010．12．10查找相关资料，写文献综述。

2010．12．10—2009.12，30写开题报告，翻译英文文献。

2011.2.15—2009.3.1开题报告答辩开题报告整改，最后定题；确定实验方案。

2011.3.2—2011.5.10完成实验，撰写毕业论文。

2011.5.11—2011.5.30指导教师修改，评阅，评阅教师评阅，并整改，定稿，并完成PPT 的制作，准备论文答辩。