基因工程的基本操作程序教学课件

基 因 组 文 库 的 构 建 模 式 图
部 分 基 因 文 库 的 构 建 模 式 图
基因组文库和部分基因文库的比较
文库类型 文库大小 基因中启动子 基因中内含子 基因多少 物种间基因交流
cDNA文库 小
无 无 某种生物的部 分基因 可以
基因组文库 大
有
有 某种生物的全部 Байду номын сангаас因 部分基因可以
Bt毒素蛋白
抗体
苏云金杆菌
组 织 培 养 脱 分 化
将Bt毒蛋白注 射小鼠体内
从小鼠血管 抽出血液分 离出抗Bt毒 素的抗体
提 蛋白质
取
出现 杂交带
（二）鉴定（个体生物学水平）
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
❖目的基因的表达和检测
类 型
步骤 检测内容
方法
结果显示
第一 目的基因是否进 DNA分子杂交
分
步 入受体细胞 （DNA和DNA之间）
子 第二 目的基因是否转 分子杂交技术
检
步 录出mRNA
（DNA和mRNA之间）
测
第三 步
目的基因是否翻 译出蛋白质
抗原—抗体杂交
是否成功显示 出杂交带
是否成功显示 出杂交带
是否成功显示 出杂交带
个
体
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及
水
抗性的程度；
蛋白质的氨基酸序列
推测
mRNA的核苷酸序列
推测
基因的核苷酸序列
化学合成
目的基因
思考：化学法合
成的目的基因含内含 子、启动子和终止子 吗？
课归堂纳小：结 获取目的基因的方法
1、从基因文库中获取
种 基因组文库：含有一种生物的全部基因 类 部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
2、利用PCR技术扩增
②转化过程:
Ti质粒
构建
表 达
转入
农 杆
导入
目的基因
载 体
菌
植 物 细 胞
插入
植物细胞 染色DNA
表达
新 性 状
（2）基因枪法
适用于单子叶植物
基因枪法又称微 弹轰击法，是利用压 缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表 面的表达载体DNA打 入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表 达的方法。
（3）花粉通道法 适用于被子植物
双链DNA模板在热作用下，
_氢__键__断裂，形成_单__链__D_N_A_
b、退火（复性55℃-65℃）： 系统温度降低，引物与DNA
模板结合，形成局部双链
________。
c、延伸（70℃-75℃）：在 Taq酶的作用下，合成与模
板互补的_D_N__A_链___。
d.重复a.b.c步骤：每重复 一次，目的基因增加_一__倍
将目的基因导入
动物细胞
——显微注射法
将目的基因导入 微生物细胞
——感受态细胞
1.将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
（1）农杆菌转化法
①特点： 易感染双子叶植物和裸子 植物，对大多数单子叶植 物没有感染能力。
Ti质粒上的T-DNA可以转移 到受体细胞，并整合到受体 细胞染色体的DNA上。
探针
15N
15N
转基因生 14N 物的DNA 14N
变性 变性
1、检测——分子水平的检测 （2）检测目的基因是否转录出了mRNA
方法—— DNA与mRNA杂交技术
探针
15N
15N
变性
转基因生物 的mRNA
14N
14N
1、检测——分子水平的检测
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法——抗原-抗体杂交
PCR技术的操作过程
PCR技术的操作过程
PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增
PCR技术扩增与DNA复制的比较
DNA复制
PCR技术
场所
主要在细胞核内
体外复制
原理
碱基互补配对原则
碱基互补配对原则
条件 解旋方式
四种脱氧核苷酸、模 板、酶、ATP
解旋酶催化解旋
四种脱氧核苷酸、 模板、酶、引物
抗虫棉的培育的过程：
基因工程的基本操作程序
（1）目的基因的获取 （2） 基因表达载体的构建 （3）将目的基因导入受体细胞 （4）目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
1.目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因
2.获取方法： （1）从基因文库中获取目的基因； （2）利用PCR技术扩增目的基因； （3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成
平
基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是
鉴
否相同等。
定
归纳: 基因工程的基本操作程序
1. 获取目的基因
从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成
2. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
感受细胞法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注 射法（动物）
B、目的基因与运载体结合
C、将目的基因导入受体细胞
D、目的基因的检测和表达
【拓展深化】 只有第三步将目的基因导入受 体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉 及碱基互补配对
课堂练习
即时应用(随学随练，轻松夺冠) 5．(2009年高考浙江卷)下列关于基因工程的叙述， 错误的是( D ) A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生 物 B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的 工具酶 C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原 无生物活性 D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细 胞和促进目的基因的表达
1 概念： PCR全称为_多__聚__酶__链__式__反__应__，是一项 在生物体__外__复制_特__定__D_N_A_片__段_的核酸合成技术。
2 原理：DNA复制 原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷 酸；热稳定DNA聚合酶
3 前提： 已知目的基因的一段核苷酸序列
aP、CDRNA技变术性的（操90℃作-过95程℃）：
3、人工合成
二、构建表达载体
思考：为什么要构建基因表达载体？
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在 并可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够表达和发挥作用。
思考：作为基因工程表达载体，
只需含有目的基因就可以完成任务 吗？
不可以。
因为目的基因在表达载体中得到表达 并发挥作用，还需要有其他控制元件，如 启动子、终止子和标记基因等。
2.基因表达载体的组成：
a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因
它们有什么作用？
启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片段，
它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有 了它才能驱动基因转录出mRNA。
终止子：位于基因尾端的一段特殊的DNA片段，
能终止mRNA的转录。
标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从
DNA在高温下变性解旋
酶
细胞内的DNA聚合酶、 解旋酶等
热稳定的DNA聚合酶
特点
半保留复制、 边解旋边复制
半保留复制、 全解旋再复制
结果
形成整个DNA分子
大量的DNA片段
过程：变性、退火、延伸三步曲
➢ 变性：90～95℃ ➢ 退火：55～60℃ ➢ 延伸：70～75℃
3. 人工合成法
利用DNA合成仪人工合成的前提：基因较小，核苷酸 序列已知
课堂练习
3、有关基因工程的叙述正确的是 （ D）
A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供 资料
课堂练习
4、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施
工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基
互补配对的步骤是
（ ）C
A、人工合成目的基因
2 目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定 维持和表达？ 不一定，需要检测
四、目的基因的检测与鉴定
检测:
是否插入目的基因 是否转录 是否翻译
鉴定:
分子水平鉴定 个体生物学水平鉴定
1、检测——分子水平的检测 （1）检测是否插入了目的基因
方法—— DNA分子杂交技术（DNA与DNA） 基因探针：放射性同位素等标记的DNA分子
补：DNA复制过程： 作用：把单个脱氧核苷
酸连接成链(形成磷酸二 酯键)
1)解旋 解旋酶催化
模板 同时进行(边解旋边复制)
2)合成互补子链 以母链为模板进行 碱基配对(在DNA聚合酶的催化 下,利用游离的脱氧核苷酸进行)
3)形成新的DNA分子
母链（旧链） 子代DNA: 组成
子链（新链）
2.利用PCR技术扩增目的基因
（2）操作程序:
提纯含目的基因表达载体 取受精卵 显微注射
移植到输卵管或子宫 受精卵发育 新性状动物
3.将目的基因导入微生物细胞
常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌
微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
过程：
Ca2+处理大 肠杆菌
感受态 细胞
表达载体 与感受态 细胞混合
感受态 细胞吸 收DNA
4. 目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译；个体
课堂练习
1、有关基因工程的叙述中，错误的是( A) A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起
来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶
课堂练习
2、下列属于获取目的基因的方法的是( D) ①利用mRNA反转录形成 ②从基因组文库中提取 ③从受体细胞中提取 ④利用PCR技术 ⑤利用DNA转录 ⑥人工合成 A.①②③⑤ B.①②⑤⑥ C.①②③④ D.①②④⑥
植物花粉在柱头 上萌发后，花粉管要 穿过花柱直通胚囊。 花粉管通道法就是在 植物受粉后，花粉形 成的花粉管还未愈合 前，剪去柱头，然后， 滴加DNA（含目的基 因），使目的基因借 助花粉管通道进入受 体细胞。
2.将目的基因导入动物细胞
（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提 纯，用显微仪注射到受精卵中）
补：原核细胞的基因结构
非编码区
编码区
编码区上游
启动子
RNA聚合酶的 始结合位点
补：真核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游
编码区
启动子
非编码区
编码区下游
终止子
RNA聚合酶的 末结合位点
非编码区 编码区下游 终止子
外显子 内含子
外显子
内含子
结构基因
转录、加工修饰
mRNA
外显子： 能够编码蛋白质的序列叫做外显子
小结：将目的基因导入受体细胞
受体生物 受体细胞
植物
受精卵 体细胞
动物
受精卵
导入方法
农杆菌转化法 基因枪法
花粉管通道法
显微注 射技术
微生物
细胞/个体
用Ca2+处理成 感受态细胞
四、目的基因的检测与鉴定
1 导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？ 真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。
而将有目的基因的细胞筛选出来。
思考：载体与表达载体的异同
相同点：都有标记基因和复制原点。 不同点：表达载体在载体基础上增加了目
的基因、启动子、终止子三部分 结构。
基因表达载体的构建过程
质粒
DNA分子
同一种 限制酶切割
用同一种限制酶分别切割目的基因个质粒，
使之露出相同的粘性末端，并用DNA连接酶
使之连接
一个切口 两个黏性末端
两个切口 获得目的基因
DNA连接酶连接
重组DNA分子（重组质粒）
三、将目的基因导入受体细胞
（一）转化：目受的体基 细因 胞进 内入 维持_受_稳__体__定__细____胞_和__内表__，达_并_的且过在程
（二）方法
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
内含子：不能够编码蛋白质的序列叫做内含子
（一）从基因文库中获取目的基因（序列未知）
1. 基因文库
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导 入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含 有这种生物的不同基因，称为基因文库。
基因文库
基因组文库
部分基因文库 （cDNA文库）
基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存 受体菌，菌中含基因。