星点设计-响应面法优化左金方提取工艺-王燕
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黄连、吴茱萸购自山东宏济堂医药有限公司，
收稿日期：2015-03-14 作者简介：王燕（1989-），女，山东烟台人，硕士研究生，研究方向：中药新药开发及新剂型研究。 通讯作者：张华（1967-），女，山东青岛人，副教授，博士，研究方向：中药新药开发及新剂型研究。E-mail：zhongyiyao77@126.com。
方中重用黄连为君药，黄连性味苦寒，配以辛 热的吴茱萸能减轻黄连的苦寒败胃之弊，吴茱萸起 反佐的作用，二药之性，以辛热配苦寒，以苦降配辛 开 [3]。研究表明黄连和吴茱萸的有效成分主要是生 物碱类，黄连主要含有小檗碱、巴马丁、黄连碱、药根 碱，其中小檗碱含量最高，有的可达 10%[4]。
传统中药活性成分提取工艺的优化有正交设 计法和均匀设计法，但这两种方法实验精密度不够， 建立的数学模型预测性较差 [5]。星点设计（central composite design，CCD）是多因素五水平的实验设 计，是 在 二 水 平 析 因 设 计 的 基 础 上 加 上 极 值 点 和 中心点构成的，具有试验次数少、试验精密度高等 特 点，在 药 学 应 用 上 成 效 显 著 [6]。 响 应 面 分 析 法 （response surface method，RSM）是通过对响应面等
精 密 称 取 盐 酸 小 檗 碱、盐 酸 巴 马 汀 对 照 品 适 量，加甲醇制成每毫升分别含盐酸小檗碱 94.4 μg 和盐酸巴马汀 52.4 μg 的混合对照品溶液，摇匀，即 得。 2.2.3 供试品溶液的制备
精密量取提取液 1.5 mL，加入 1 g 硅藻土，干燥 研细，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 - 盐酸（100∶ 1）的混合溶液 50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功 率 250 W，频率 40 kHz）30 min，放冷，再称定重量， 用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤 液 2 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤 过，取续滤液，即得。[8] 2.2.4 线性关系考察
Leabharlann Baidu
值线的分析寻找最优工艺参数，采用多元线性拟合 或二项式回归分析来表达因素与响应值之间函数关 系的一种统计方法，使用起来直观、方便、效果好 [7]。
本实验以盐酸小檗碱、盐酸巴马汀含量为评价 指标，采用星点实验设计，响应面分析法进行提取工 艺优化，为左金方的深入研究奠定基础。 1 材料 1.1 仪器
（mL） 量（mg） （mg） （mg） 0.75 5.4696 4.3757 9.7023 0.75 5.4696 4.3757 9.7068 0.75 5.4696 4.3757 9.8172 0.75 5.4696 5.4696 10.8967 0.75 5.4696 5.4696 10.9023 0.75 5.4696 5.4696 10.9112 0.75 5.4696 6.5635 11.7867 0.75 5.4696 6.5635 11.8766 0.75 5.4696 6.5635 11.9856 0.75 1.1489 0.9191 2.0123 0.75 1.1489 0.9191 2.0212 0.75 1.1489 0.9191 2.0278 0.75 1.1489 1.1489 2.2767 0.75 1.1489 1.1489 2.2815 0.75 1.1489 1.1489 2.2897 0.75 1.1489 1.3787 2.5087 0.75 1.1489 1.3787 2.5147 0.75 1.1489 1.3787 2.5198
DFY-300 中药粉碎机（温岭市林大机械有限公 司）；R1002 型旋转蒸发器（上海申顺生物科技有限公 司）；DZF-6051 型真空干燥箱（上海精宏试验设备有 限公司）；LC-2010A 型高效液相色谱仪（日本岛津）； KQ-500E 型超声波提取器（昆山市超声仪器有限公 司）；AB135-S 十万分之一型天平（瑞士梅特勒 - 托利 多仪器有限公司）；AL-204 型万分之一天平（瑞士梅 特勒 - 托利多仪器有限公司）；PK-S24 型电热恒温水 浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；TDL-5-A 型飞 鸽牌离心机（上海安亭科学仪器厂）；KDM 型可调控 温电热套（山东鄄城华鲁电热仪器有限公司）。 1.2 药材
关键词：左金方；星点设计 - 响应面法；盐酸小檗碱；盐酸巴马汀 中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1673-842X ( 2015) 12- 0043- 0 4
Optimization of Extraction Technology for the Zuojin Decoction by Central Composite Design and Response Surface Methodology
第 1 7 卷 第 1 2 期 2015 年 12 月
辽宁中医药大学学报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 17 No. 12 Dec .，2015
DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2015.12.013
星点设计 - 响应面法优化左金方提取工艺
精 密 量 取 同 一 批 提 取 液 1.5 mL，共 取 6 份，按 “2.1.3”项下的方法制备供试品溶液，测定，记录盐
44
酸小檗碱和盐酸巴马汀的峰面积，计算含量，结果
RSD 分别为 1.15%、1.36%，表明该方法的重复性良
好。
2.2.8 加样回收率
精密量取同一批提取液 0.75 mL，共 9 份，分别
Key words：Zuojin Decoction；central composite design and response surface method；berberine hydrochloride；martin hydrochloride
左金丸出自《丹溪心法 · 火六》，为丹溪名方之 一，由黄连、吴茱萸按 6∶1 的比例组成。收载于《中 华人民共和国药典》2010 年版一部。可以清肝胆之 火、泻脾胃之热，具有和胃降逆、制酸止呕之功效，主 治肝火胁痛、胃脘痛、呕吐吞酸等症 [1]。现代药理研 究表明，左金丸有抑制胃酸分泌、抗溃疡、抑菌、镇痛 抗炎等药理作用 [2]。
取“2.1.2”项 下 混 合 对 照 品 溶 液 5 μL，按 “2.1.1”项下色谱条件进行测定，连续进样 6 次，记录
峰面积。结果，盐酸小檗碱、盐酸巴马汀峰面积的 RSD 分别为 0.86%、0.97%，表明测定方法精密度良 好。 2.2.6 稳定性考察
精 密 吸 取 同 一 供 试 品 溶 液，分 别 于 0、2、4、8、 12、24 h 各进样 5 μL，测定，计算各峰面积的 RSD。 结果，盐酸小檗碱、盐酸巴马汀峰面积的 RSD 分别 为 1.63%、1.49%，表明供试品溶液在 24 h 内稳定。 2.2.7 重复性考察
称取左金方中的处方量药物，按一定的方法进 行提取，经滤过浓缩，定容至 250 mL。 2.2 盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的含量测定 2.2.1 色谱条件
色谱柱：Kromasil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相：乙腈 -0.3% 磷酸水溶液（25∶75）；流速： 1 mL·min-1；检测波长：265 nm；柱温：30 ℃；进样 量：5 μL 2.2.2 混合对照品溶液的制备
精密加入各对照品，摇匀，按“2.1.3”项下制备供试
品，按“2.1.1”项下的色谱条件进行测定，计算平均
回收率分别为 99.12%、98.84%，RSD 分别为 0.68%、
0.90%，结果表明该方法有很好的回收率。见表 1。
表 1 加样回收试验结果（n=9）
化合物
盐酸小 檗碱
盐酸巴 马汀
取样量 样品中 加入量 测得量
43
辽宁中医药大学学报
17 卷
黄 连 为 毛 茛 科 植 物 黄 连（Coptis chinensis Franch.） 的干燥根茎；吴茱萸为芸香科植物吴茱萸 [Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.] 的干燥近成熟果实，经本 校李峰教授鉴定均为正品。 1.3 试剂
盐 酸 小 檗 碱 对 照 品：购 自 中 国 药 品 生 物 制 品 鉴 定 所（批 号 110807-200205，供 含 量 测 定 用）；盐 酸巴马汀对照品：购自上海原叶科技有限公司（批 号 20121016，供含量测定用）；乙腈为色谱纯（美国 Fisher 公司）；娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 左金方的提取方法
王燕，张华，张群
（山东中医药大学，山东 济南 250355）
摘 要：目的：采用星点设计 - 响应面法优化左金方的提取工艺。方法：选取对提取工艺影响较大的乙醇浓度、 溶媒比、提取时间为考察因素，以盐酸小檗碱、盐酸巴马汀含量为考察指标，对其进行综合评定，优选最佳提取工艺 条件。结果：最佳提取工艺为 8.25 倍量 70.57% 乙醇提取 3 次，每次 90.71 min，按优化后处方提取的盐酸小檗碱、盐酸 巴马汀的含量较高。结论：星点设计 - 响应面法优化左金方的提取工艺，方法简便，预测性良好。
精密吸取对照品溶液 1、2、5、8、10 μL，分别注 入高效液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件进行测 定，记录色谱峰峰面积，以峰面积积分值（Y）为纵坐 标，对照品进样量 X（μg）为横坐标，绘制标准曲线， 盐 酸 小 檗 碱 线 性 回 归 方 程 为 Y=3×106X-14692， r=0.9992，其线性范围为 0.0944~0.944 μg；盐酸巴马 汀线性回归方程为 Y=3×106X-273.63，r=0.9999，其 线性范围为 0.0524~0.524 μg。 2.2.5 精密度考察
WANG Yan，ZHANG Hua，ZHANG Qun （Shandong University of Tranditional Chinese Medicine，Ji'nan 250355，Shandong，China）
Abstract：Objective ：To optimize extraction techniques for Zuojin Decoction by using central composite design and response surface method. Methods：Selection of extraction larger effects of ethanol concentration、the solvent ratio，extraction time as factors.Berberine hydrochloride in Pakistan，Martin content as investigation index.The comprehensive evaluation for the optimized extraction conditions. Results：The optimized extraction technology was 8.25 times amount of 70.57% alcohol and extracting for 3 times，each time 90.71 min.The content of berberine hydrochloride，martin hydrochloride in higher，after the optimization prescription extracted. Conclusion：Central composite design and response surface methodology is convenient and highly predictive for optimizing the extraction process of Zuojin Decoction.
收稿日期：2015-03-14 作者简介：王燕（1989-），女，山东烟台人，硕士研究生，研究方向：中药新药开发及新剂型研究。 通讯作者：张华（1967-），女，山东青岛人，副教授，博士，研究方向：中药新药开发及新剂型研究。E-mail：zhongyiyao77@126.com。
方中重用黄连为君药，黄连性味苦寒，配以辛 热的吴茱萸能减轻黄连的苦寒败胃之弊，吴茱萸起 反佐的作用，二药之性，以辛热配苦寒，以苦降配辛 开 [3]。研究表明黄连和吴茱萸的有效成分主要是生 物碱类，黄连主要含有小檗碱、巴马丁、黄连碱、药根 碱，其中小檗碱含量最高，有的可达 10%[4]。
传统中药活性成分提取工艺的优化有正交设 计法和均匀设计法，但这两种方法实验精密度不够， 建立的数学模型预测性较差 [5]。星点设计（central composite design，CCD）是多因素五水平的实验设 计，是 在 二 水 平 析 因 设 计 的 基 础 上 加 上 极 值 点 和 中心点构成的，具有试验次数少、试验精密度高等 特 点，在 药 学 应 用 上 成 效 显 著 [6]。 响 应 面 分 析 法 （response surface method，RSM）是通过对响应面等
精 密 称 取 盐 酸 小 檗 碱、盐 酸 巴 马 汀 对 照 品 适 量，加甲醇制成每毫升分别含盐酸小檗碱 94.4 μg 和盐酸巴马汀 52.4 μg 的混合对照品溶液，摇匀，即 得。 2.2.3 供试品溶液的制备
精密量取提取液 1.5 mL，加入 1 g 硅藻土，干燥 研细，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 - 盐酸（100∶ 1）的混合溶液 50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功 率 250 W，频率 40 kHz）30 min，放冷，再称定重量， 用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤 液 2 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤 过，取续滤液，即得。[8] 2.2.4 线性关系考察
Leabharlann Baidu
值线的分析寻找最优工艺参数，采用多元线性拟合 或二项式回归分析来表达因素与响应值之间函数关 系的一种统计方法，使用起来直观、方便、效果好 [7]。
本实验以盐酸小檗碱、盐酸巴马汀含量为评价 指标，采用星点实验设计，响应面分析法进行提取工 艺优化，为左金方的深入研究奠定基础。 1 材料 1.1 仪器
（mL） 量（mg） （mg） （mg） 0.75 5.4696 4.3757 9.7023 0.75 5.4696 4.3757 9.7068 0.75 5.4696 4.3757 9.8172 0.75 5.4696 5.4696 10.8967 0.75 5.4696 5.4696 10.9023 0.75 5.4696 5.4696 10.9112 0.75 5.4696 6.5635 11.7867 0.75 5.4696 6.5635 11.8766 0.75 5.4696 6.5635 11.9856 0.75 1.1489 0.9191 2.0123 0.75 1.1489 0.9191 2.0212 0.75 1.1489 0.9191 2.0278 0.75 1.1489 1.1489 2.2767 0.75 1.1489 1.1489 2.2815 0.75 1.1489 1.1489 2.2897 0.75 1.1489 1.3787 2.5087 0.75 1.1489 1.3787 2.5147 0.75 1.1489 1.3787 2.5198
DFY-300 中药粉碎机（温岭市林大机械有限公 司）；R1002 型旋转蒸发器（上海申顺生物科技有限公 司）；DZF-6051 型真空干燥箱（上海精宏试验设备有 限公司）；LC-2010A 型高效液相色谱仪（日本岛津）； KQ-500E 型超声波提取器（昆山市超声仪器有限公 司）；AB135-S 十万分之一型天平（瑞士梅特勒 - 托利 多仪器有限公司）；AL-204 型万分之一天平（瑞士梅 特勒 - 托利多仪器有限公司）；PK-S24 型电热恒温水 浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；TDL-5-A 型飞 鸽牌离心机（上海安亭科学仪器厂）；KDM 型可调控 温电热套（山东鄄城华鲁电热仪器有限公司）。 1.2 药材
关键词：左金方；星点设计 - 响应面法；盐酸小檗碱；盐酸巴马汀 中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1673-842X ( 2015) 12- 0043- 0 4
Optimization of Extraction Technology for the Zuojin Decoction by Central Composite Design and Response Surface Methodology
第 1 7 卷 第 1 2 期 2015 年 12 月
辽宁中医药大学学报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 17 No. 12 Dec .，2015
DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2015.12.013
星点设计 - 响应面法优化左金方提取工艺
精 密 量 取 同 一 批 提 取 液 1.5 mL，共 取 6 份，按 “2.1.3”项下的方法制备供试品溶液，测定，记录盐
44
酸小檗碱和盐酸巴马汀的峰面积，计算含量，结果
RSD 分别为 1.15%、1.36%，表明该方法的重复性良
好。
2.2.8 加样回收率
精密量取同一批提取液 0.75 mL，共 9 份，分别
Key words：Zuojin Decoction；central composite design and response surface method；berberine hydrochloride；martin hydrochloride
左金丸出自《丹溪心法 · 火六》，为丹溪名方之 一，由黄连、吴茱萸按 6∶1 的比例组成。收载于《中 华人民共和国药典》2010 年版一部。可以清肝胆之 火、泻脾胃之热，具有和胃降逆、制酸止呕之功效，主 治肝火胁痛、胃脘痛、呕吐吞酸等症 [1]。现代药理研 究表明，左金丸有抑制胃酸分泌、抗溃疡、抑菌、镇痛 抗炎等药理作用 [2]。
取“2.1.2”项 下 混 合 对 照 品 溶 液 5 μL，按 “2.1.1”项下色谱条件进行测定，连续进样 6 次，记录
峰面积。结果，盐酸小檗碱、盐酸巴马汀峰面积的 RSD 分别为 0.86%、0.97%，表明测定方法精密度良 好。 2.2.6 稳定性考察
精 密 吸 取 同 一 供 试 品 溶 液，分 别 于 0、2、4、8、 12、24 h 各进样 5 μL，测定，计算各峰面积的 RSD。 结果，盐酸小檗碱、盐酸巴马汀峰面积的 RSD 分别 为 1.63%、1.49%，表明供试品溶液在 24 h 内稳定。 2.2.7 重复性考察
称取左金方中的处方量药物，按一定的方法进 行提取，经滤过浓缩，定容至 250 mL。 2.2 盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的含量测定 2.2.1 色谱条件
色谱柱：Kromasil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相：乙腈 -0.3% 磷酸水溶液（25∶75）；流速： 1 mL·min-1；检测波长：265 nm；柱温：30 ℃；进样 量：5 μL 2.2.2 混合对照品溶液的制备
精密加入各对照品，摇匀，按“2.1.3”项下制备供试
品，按“2.1.1”项下的色谱条件进行测定，计算平均
回收率分别为 99.12%、98.84%，RSD 分别为 0.68%、
0.90%，结果表明该方法有很好的回收率。见表 1。
表 1 加样回收试验结果（n=9）
化合物
盐酸小 檗碱
盐酸巴 马汀
取样量 样品中 加入量 测得量
43
辽宁中医药大学学报
17 卷
黄 连 为 毛 茛 科 植 物 黄 连（Coptis chinensis Franch.） 的干燥根茎；吴茱萸为芸香科植物吴茱萸 [Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.] 的干燥近成熟果实，经本 校李峰教授鉴定均为正品。 1.3 试剂
盐 酸 小 檗 碱 对 照 品：购 自 中 国 药 品 生 物 制 品 鉴 定 所（批 号 110807-200205，供 含 量 测 定 用）；盐 酸巴马汀对照品：购自上海原叶科技有限公司（批 号 20121016，供含量测定用）；乙腈为色谱纯（美国 Fisher 公司）；娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 左金方的提取方法
王燕，张华，张群
（山东中医药大学，山东 济南 250355）
摘 要：目的：采用星点设计 - 响应面法优化左金方的提取工艺。方法：选取对提取工艺影响较大的乙醇浓度、 溶媒比、提取时间为考察因素，以盐酸小檗碱、盐酸巴马汀含量为考察指标，对其进行综合评定，优选最佳提取工艺 条件。结果：最佳提取工艺为 8.25 倍量 70.57% 乙醇提取 3 次，每次 90.71 min，按优化后处方提取的盐酸小檗碱、盐酸 巴马汀的含量较高。结论：星点设计 - 响应面法优化左金方的提取工艺，方法简便，预测性良好。
精密吸取对照品溶液 1、2、5、8、10 μL，分别注 入高效液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件进行测 定，记录色谱峰峰面积，以峰面积积分值（Y）为纵坐 标，对照品进样量 X（μg）为横坐标，绘制标准曲线， 盐 酸 小 檗 碱 线 性 回 归 方 程 为 Y=3×106X-14692， r=0.9992，其线性范围为 0.0944~0.944 μg；盐酸巴马 汀线性回归方程为 Y=3×106X-273.63，r=0.9999，其 线性范围为 0.0524~0.524 μg。 2.2.5 精密度考察
WANG Yan，ZHANG Hua，ZHANG Qun （Shandong University of Tranditional Chinese Medicine，Ji'nan 250355，Shandong，China）
Abstract：Objective ：To optimize extraction techniques for Zuojin Decoction by using central composite design and response surface method. Methods：Selection of extraction larger effects of ethanol concentration、the solvent ratio，extraction time as factors.Berberine hydrochloride in Pakistan，Martin content as investigation index.The comprehensive evaluation for the optimized extraction conditions. Results：The optimized extraction technology was 8.25 times amount of 70.57% alcohol and extracting for 3 times，each time 90.71 min.The content of berberine hydrochloride，martin hydrochloride in higher，after the optimization prescription extracted. Conclusion：Central composite design and response surface methodology is convenient and highly predictive for optimizing the extraction process of Zuojin Decoction.