基因工程：第七章

第七章克隆基因的表达

7.1 基因表达的含义

生物的遗传信息是以基因的形式储存在DNA分子上的，将DNA分子所承载的遗传信息转变为由特定氨基酸顺序构成的多肽或蛋白质分子的过程，即为基因的表达（gene expression）。

基因表达的过程为：

利用各种先进的基因导入技术及细胞培养方法已实现了外源基因在动植物及酵母等真核宿主细胞中的表达。利用真核细胞作宿主表达系统的优点是：能识别和除去外源基因中的内含子，加工形成成熟的mRNA，即带内含子的天然基因是可以利用的；真核细胞将表达的蛋白糖基化，而大肠杆菌表达的蛋白是无糖基化的，糖基化对某些表达蛋白的免疫原性影响很大。

真核细胞作宿主表达系统尚存在以下几个问题：

转化真核细胞的效率低；

表达效率不够高；

细胞培养（动植物）工艺较复杂，成本高；

选择标记及选择系统较少。

总体而言，真核细胞作为表达宿主尚不成熟，有待于进一步发展、完善。目前普遍采用原核生物作为表达宿主，原核生物（大肠杆菌）繁殖速度快，培养简单，因此一些用传统和常规方法不能或难以大量生产的有生理活性的蛋白，如果采用“工程菌”来生产就方便得多。

7.2 外源基因在大肠杆菌中表达的基本条件

基因的编码区域内必须无插入序列（无内含子），因为原核细胞中缺乏拼接加工系统；

基因必须置于大肠杆菌启动子的控制之下，并能有效地为大肠杆菌RNA聚合酶所识别和转录；

所生成的mRNA必须稳定，且转译效率高；

表达产物不会被宿主细胞的蛋白酶迅速降解。

7.3 影响基因表达的主要因素

7.3.1 转录

转录指遗传信息从DNA分子转移到RNA分子的过程，是以DNA分子中的一条链（有意义链、转录链）为模板，在转录酶的催化下，进行的一种聚合反应。转录酶即依赖于DNA 的RNA聚合酶。

大肠杆菌的RNA聚合酶由五个亚基________组成，分子量约46万。完整的RNA聚合酶，即________称为全酶（holoenzyme）；没有__亚基的RNA聚合酶称为核心酶（coreenzyme）。__亚基（__因子）容易同核心酶解离，其功能是使核心酶能稳定地结合到DNA的启动子上，故又称为起始因子。

真核生物有三种不同的RNA，因而其RNA聚合酶也有三种，分别参与不同类型的RNA 分子的合成。

由RNA聚合酶催化的转录过程可分为起始、延长和终止三个步骤。

7.3.1.1 启动子

标志基因转录起始的位点称启动子。在大肠杆菌中，启动子被RNA聚合酶的λ因子所识别。启动子是一段DNA序列，常位于基因或操纵子编码顺序的上游，RNA聚合酶结合在上面。

1. 原核细胞的启动子

原核细胞的启动子在转录起始点的上游有两个高度保守的区域：

位于转录起始点上游约10个bp的-10区域，TATAAT序列（pribnow box），也称-10序列。-10序列的实际位置在不同启动子中略有变动，其不同碱基的出现频率为：T89A89T50A65A65T100 。-10序列有助于DNA局部双链解开，因为-10序列含有较多的A-T对，所以双链分开所需的能量较低。

中心约在-35位置的TTGACA序列，也称为-35序列或识别区。各碱基出现的频率为：T83T83G81A61C69A52 。-35序列提供RNA聚合酶识别的信号。

这两个区域对于决定启动子的强度非常重要，事实上很小的差异对启动子指导转录的效率有重大影响。一般启动子序列与保守序列相似程度越高，启动子就越强。

强启动子是能维持高频率转录的启动子，通常控制那些细胞需要其大量转译产物的基因转录；而弱启动子具有相对较低的转录效率，指导那些仅需要其少量转译产物的基因转录。

利用基因工程技术，可将由弱启动子所控制的基因放在强启动子的下游，从而获得高效表达。

两个保守区之间的DNA对启动子的功能也有影响，各启动子都需要一些最适的间隙，通常认为间隙为17 bp的启动子功能较强。

2. 真核细胞启动子中可以找到三个保守区：

位于-12至-32 bp之间的TATA框，序列为TATAATATA，其功能可能为DNA双链开始解开并决定转录的起点位置。

位于-70至-80 bp区域的CAAT框，序列为GGTCAATCT，其主要作用可能与RNA聚合酶的结合有关。

位于更上游约-70至-100 bp处的GC框，序列为GGGCGG，也称为增强子（enhancer），其作用为促进基因的转录，对基因的表达可产生显著的增强作用。增强子有时位于基因3’端下游区或在内含子中。

CAAT框和GC框均为上游因子（upstream elements），它们对转录的起始频率有较大的影响。

真核生物的启动子极为复杂，不同启动子之间的差异较大。

例如5s rRNA基因，启动子在基因下游，且在基因内部：

又如爪蟾tRNAMet基因，启动子分成两部分：

真核生物与原核生物的基因结构和转录转译过程均有明显差异，大肠杆菌的RNA聚合酶不能识别动物启动子顺序，真核细胞的启动子在原核细胞中功能很差，所以要得到真核细胞蛋白的有效表达，应将真核基因放在原核细胞的强启动子控制之下。

3. 常用于表达载体的启动子：

PLac ：乳糖启动子，是控制Lac Z基因转录的序列。Lac启动子可被IPTG诱导，加入该试剂到培养基后，将使表达载体中Lac启动子下游插入的基因开始转录，表达产物为包含β半乳糖苷酶的融合蛋白。

Ptrp ：色氨酸启动子，通常是编码参与色氨酸生物合成过程中的几种酶的基因簇上游序列。trp启动子被色氨酸抑制，但易被β吲哚丙烯酸诱导，也可用色氨酸饥饿诱导，所合成的蛋白质产量高于PLac表达载体系统。

PL ：λ噬菌体左向启动子，负责λDNA分子转录的启动子之一。PL是一种可被大肠杆菌RNA聚合酶识别的强启动子，该启动子被λcI基因产物所抑制，用λPL构建的表达载体上结合一个温敏型λ阻遏物基因（λcI857），在较低温度（低于30℃）下cI蛋白可抑制PL，在较高温度（42℃）时cI蛋白失活，导致克隆基因的转录。

Ptac ：由Ptrp和PLac杂合而成，启动效果比二者均强，仍可被IPTG诱导。目前市售的Ptac有两类（PtacI和PtacII）。