13看第十三章 植物细胞的遗传转化
植物基因转化常用方法(植物遗传,农杆菌、病毒介导和基因枪转化法)
一. 植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。
另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
二.农杆菌介导的基因转化方法（一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。
它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。
其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。
农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。
T－DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。
第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。
1. Ti质粒的结构在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。
Ti质粒大约在160～240kB之间。
其中T-DNA大约在15kb-30kb。
Vir基因区在36kb 左右。
除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。
T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。
植物遗传转化技术
binary vector
• 包括mini-Ti质粒（T-DNA边界，缺失Vir区）和 helper Ti质粒（含有Vir区缺失T-DNA边界，相当 于co-integrated vector 的disarmed Ti质粒） mini-Ti质粒：pBin19，pCAMBIA系列 helper Ti质粒：EHA105，LBA4404（pAL4404）
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Co-integration plasmid
• 一元载体系统A plasmid based on pBR322 used to clone gene of interest
• A Ti-based vector: pGV3850 (LB, RB, most of T-DNA replaced by pBR322)
Left border
Right border
12-24 kbp
vir genes
Opine
ori
catabolism
15
3. 创伤诱导分子
• 是一类可溶性的小分子酚类化合物 • 乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）、羟
基乙酰丁香酮（acetosyringone，OH-AS） • A.t: recognition and chemotaxis （趋化性）
• Left and right border (LB\RB):TDNA左右两侧各有一段25bp的重复 序列，在T-DNA的整合中起重要作用
• Ori区(origin of replication)：该区段 基因调控Ti质粒的自我复制，故称之 为复制起始区。
T-DNA region
Auxin Cytokinin Opine
• T-DNA和vir基因参与，T-DNA上的基因与 T-DNA的转移及整合有关，因为它不编码 T-DNA转移的产物。
植物遗传转化流程
植物遗传转化流程Genetic transformation in plants is a complex process that involves the transfer of genes into plant cells and the regeneration of transformed plants. This process has revolutionized agriculture by allowing for the development of genetically modified crops with improved traits such as resistance to pests, diseases, and environmental stress. However, the genetic transformation of plants comes with its own set of challenges and limitations.植物遗传转化是一个复杂的过程，涉及到基因的转移到植物细胞中，并且使转化植物再生。
这一过程通过允许开发具有改良特性的转基因作物，如抗虫、抗病和抗环境压力，从而使农业发生了革命性的变化。
然而，植物的遗传转化也面临着一系列的挑战和限制。
The first step in the genetic transformation of plants is the introduction of foreign genes into the plant cells. This can be achieved through various methods such as Agrobacterium-mediated transformation, biolistic transformation, and protoplast transformation. Each method has its own advantages anddisadvantages, and the choice of method depends on the target plant species and the specific traits that need to be introduced.植物遗传转化的第一步是将外源基因引入植物细胞中。
植物遗传转化
花椰菜遗传转化方法如图： 发根农杆菌介导 根瘤农杆菌介导
（三）林木遗传转化的技术
目前以掌握了杨树、白桦、桉树、落叶松、核 桃、苹果、沙田柚等树种外源基因转化技术。主要 转化方式是农杆菌介导法。增强植物抗病、耐高温、 耐旱等方面。
（四）药用植物遗传转化的技术
主要采用农杆菌介导法，其他方法成功的例子 极少。
第十七章：植物遗传转化
Section 1: 植物遗传转化的方法
Section 2: 转化植株的检测 Section 3: 几种植株遗传转化的 技术
植物遗传转化 （plan genetic transformation): 应用重组DNA技术、细胞组织培养 技术或种质 系统转化技术，有目的地将外源基因或DNA片 段插入到受体植物基因组中并通过减数分裂获 得新植株的技术。
•
（2）方法：人们将目的基因插入到经过 改造的T—DNA区，借助农杆菌的感染实现外 源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过 细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中， 近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物 (尤其是水稻)中也得到了广泛应用。
（3）转化步骤可简单概括为以下方面：
Section 2: 转化植株的检测
以报告基因检测为例：
报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶
的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被 鉴定的基因。目前主要的报告基因如下：
Section 3: 几种植株遗传转化的技术
（一）大田作物遗传转化的技术
①油菜的遗传转化技术 农杆菌介导转化法：根据不同的基因型选择适的培养基。
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大 多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重 组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/ 分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定 （这个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见 第五步） 几种方法进行检验（根据要求选取不同方 法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物 体进行个体生物学水平鉴定。
植物组织培养：第十三章 植物遗传转化
• 接种时所用菌液浓度和侵染时间 是影响转基因植株再生的关键因素 之一。
• 共培养：接种菌体后的外植体培养 在诱导愈伤组织或不定芽固体培养基 上，在外植体细胞分裂、生长的同时， 农杆菌在外植体切口面也增殖生长， 两者共同培养的过程称为～。
• Horsch等(1985)首创叶盘法，用根 癌农杆菌感染烟草叶片外植体，获得 了转基因烟草。
（一）生物学特性与转 化原理
1.生物学特性
• 根癌农杆菌将Ti质粒的DNA片 段、发根农杆菌将Ri质粒的DNA 片段导入植物细胞的基因组中，导 致植物发生冠瘿瘤和毛状根。
• 根据携带不同Ti质粒的根癌农杆 菌诱导的冠瘿瘤所产生的冠瘿碱类 型，将根癌农杆菌分为章鱼碱型、 胭脂碱型和农杆碱型三种根癌农杆 菌。
一、农杆菌介导法
• Ackermann(1977)，Wullems等 (1981)，De Greve等(1982)和Spano 等(1982)首先在烟草和马铃薯中由Ri质 粒和Ti质粒转化的细胞再生出植株。
• Zambryski等(1983)和De Block等 (1984)以及Horsch等(1985)分别报道 了用切去癌基因的根癌农杆菌和发根 农杆菌进行遗传转化，获得了形态正 常的转基因植物。
第十三章 植物遗传转化
• 植物遗传转化（plant genetic transformation）：是指将外源基因 转移到植物体内并稳定地整合表达与 遗传的过程。
• 农杆菌介导法、基因枪法、植株原 位真空渗入法、电击法、聚已二醇法、 花粉管通道法、显微注射法、激光微 束法、超声波法、生殖细胞浸泡法、 脂质体法
（5） Vir区基因的活化
• 大多数双子叶植物受伤后，植物 细胞会分泌某些酚类化合物，这些 酚类化合物可诱导Vir区基因活化， 使农杆菌转化成为可能。
遗传转化植物的生产利用
遗传转化植物的生产利用遗传转化植物是一种将外源基因导入植物细胞的技术，使得植物拥有了新的性状和特点。
这种技术在农业、医学等领域中得到了广泛的应用。
本文将分别从遗传转化植物的生产和利用两个角度进行探讨。
遗传转化植物的生产遗传转化植物的生产包括遗传转化的过程和转化后的植物品种选育。
遗传转化过程是指将外源基因导入植物细胞的技术，这需要以各种手段将目标基因导入到植物细胞中，然后将基因表达和可持续存在的基因组整合到植物细胞核中。
整个遗传转化的过程需要依次进行实验室验证、田间试验和大规模生产，每一个阶段都需要超过一年的时间。
因此，遗传转化的生产过程非常漫长而且复杂。
在遗传转化后，科学家们要通过筛选、鉴定和组合等手段，将基因导入的植物品种进行选育。
与传统的植物育种相比，遗传转化选育更加高效快捷，同时也可以拓宽植物育种的范围和方法。
在工业方面，通过遗传转化，科学家们可以使植物具有生产工业原料的能力，如生产酿酒、造纸等方面的原料。
在农业方面，遗传转化技术可以使植物拥有抗病、耐旱等优良性状。
遗传转化植物的利用遗传转化植物的生产是为了更好地利用其所具有的优良性状，这些性状不仅包括催熟、增产、提高品质等方面，也包括延长保鲜期、防虫、防霉、增加生物安全等方面。
遗传转化植物的利用可以分为农业、医学、能源和环境等领域。
农业方面，遗传转化植物可以提高作物的产量和品质。
例如，转化花生、玉米、水稻等作物的抗病、耐旱性状，极大地提高了农作物生产力。
医学方面，遗传转化植物也具有广阔的应用前景。
例如，遗传转化小麦、大豆等植物，可以提取到植物蛋白，作为口服和注射药品的重要原料，这种方法被称为“植物制药”。
能源方面，遗传转化植物的生物质和生物燃料被广泛地应用于农业、工业、环保等领域。
它们可以替代化石燃料，减少环境污染和自然资源的消耗。
环境方面，遗传转化植物可以被用于修复生态系统，例如提高植被覆盖率，改善土壤环境。
结语随着遗传转化技术的不断进步，越来越多的植物品种可以通过遗传转化在农业、医疗、能源和环境等领域中发挥作用。
植物遗传转化
植物遗传转化植物遗传转化是指将一种基因从一种宿主植物移植到另一种植物中的过程。
这可以通过多种技术实现，包括蛋白质工程、病毒载体和质粒介导的遗传转化。
植物遗传转化的技术可以用来改变植物的性状，例如产量，耐旱性，抗病性，耐寒性，营养价值，等等。
它还允许转化植物中的基因，以改善其耐药性、耐酸碱性或其他性状。
植物遗传转化技术有着悠久的历史，最早可以追溯到使用放射性同位素来驯化植物的实验，其目标是改变植物的遗传特性，从而增加其产量。
今天，植物遗传转化的技术发展迅速，使得利用质粒介导的遗传转化技术来转移植物的基因变得越来越容易。
还有许多其他的方法，包括蛋白质工程，以及其他以病毒载体为媒介的形式，都在不断的发展和应用中。
植物遗传转化的应用在种植领域非常广泛。
这种技术可以用来增加植物抗病性，使得植物不容易受到病虫害、荒漠化或气候变化的侵袭；改善植物对营养元素的利用，改善植物的生长和发育；消除农业投入品，比如农药和化肥，使植物可以在较低的投入下获得较高的收入；改变植物的性状，比如口感、果实大小、颜色等，使得植物更受消费者欢迎；以及改变植物的耐寒性，以适应不同的气候条件，减少和消除对农作物收获量的不利影响。
随着植物遗传转化技术的发展，植物遗传转化在农业中的应用越来越广泛，许多农作物也在不断发展改造中。
植物遗传转化的技术已成为农业科学研究的重要组成部分，在当今的社会中得到了越来越多的应用，它不仅可以改善植物的效率，而且可以降低农作物的生产成本，最终提升农作物的抗病性、耐寒性、耐旱性和营养价值等性状，为世界人民提供健康、安全和有营养的生活所需。
如今，植物遗传转化技术已经成为人类运用自然环境生物资源的重要工具，但它仍然存在一定的风险。
因此，在开发和使用植物遗传转化技术之前，应当首先对技术进行全面的评估，确保它不会对自然生态、人类健康或其他有关部门造成不利影响。
同时，在开发和使用植物遗传转化技术的过程中，应当遵守有关法律法规，以确保植物遗传转化技术的安全、可靠和环保。
植物基因转化PPT课件
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克隆载体
辅助质粒
共存于同一个农杆菌中，再由 农杆菌完成目的基因向植物基 因组的转移
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四、其它DNA转化植物的方法
（一）原生质体转化 （二）基因枪 （三）整株植物转化 （四）叶绿体转化
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根癌农杆菌介导的遗传转化
3、载体类型
B、共整合载体（Cointegratevectors）
由两个部分组成：
一个缺失了T-DNA上的肿瘤诱导基因的Ti质粒 一个中间载体（intermediate vector）组成 （一种在普通大肠杆菌的克隆载体中插入了一段合适 的T-DNA片断，而构成的小型质粒 ）。
（二）、致瘤Ti质粒
200 kb
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根癌农-250kb，以下几个功能区
• 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 • 冠瘿碱代谢区 • Ti 质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移 • 毒性区（Vir）：直接参与T-DNA的转移和插入植物染色体 • DNA复制区（Rep）：参与Ti 质粒DNA复制
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根癌农杆菌介导的遗传转化
（三）、 T-DNA 的转化 1、T－DNA的结构 • 是Ti质粒中转移到植物细胞中的部分，内含冠瘿碱合成和植物
激素合成相关的基因 • A. tumefaciens 利用冠瘿碱作为生长的碳源 • 左和右边界
➢T-DNA的左边界和右边界是T-DNA 从Ti 质粒切开的位点 ➢边界包含25 碱基的重复元件 ➢只有右边界是转移所必须的，但在克隆载体中，均含有两个边界
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根癌农杆菌介导的遗传转化
植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定
植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定金万枚 巩振辉 李桂荣 张桂华(西北农业大学 陕西杨陵 712100)提 要 对现有主要植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定进行了比较分析,并对它们在植物遗传转化中的前景进行了展望。
关键词 植物;遗传转化方法;转基因植株;转基因植株鉴定 人们可通过有性杂交,物理化学诱变或自然变异来创造新物种和新品种。
但常常存在着杂交不亲和或杂种不育而造成的生殖隔离,也存在诱变的非定向性。
采用遗传转化技术,将所要求的外源目的基因导入受体植株,并通过对转化植株的鉴定选择,从而创造出人类所需要的新品种或新物种。
植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定是植物遗传转化的重要环节。
关*国家自然科学基金资助,项目编号39770522。
优质小麦品质的决定性因素;其次要有较强的生活力,保证营养生长健壮。
3.3.2 播种 研究表明,适当晚播和增加密度能在稳定产量的基础上提高小麦品质。
根据我省实际,关中优质专用小麦播量应控制在每亩6～8kg,渭北应控制在9kg。
播期可依据实际情况较当地常规适播期推迟2～3d。
提倡机械以精量半精量播种。
3.4 灌水灌水对小麦品质的影响比较复杂,尤以抽穗至成熟期间影响最大,此期灌水会降低蛋白质含量,对沉淀值等加工品质也不利,但如果氮量充足或灌水与施氮结合则蛋白质含量不下降或下降很慢。
因而施肥上的前氮后移也为后期合理灌水提供了条件。
中国农业大学曾研究出一套节水高产栽培技术,小麦春季可只灌一次,并将灌水时期移至孕穗期;若特别干旱,可在拔节期和开花期分别灌水。
这种灌水制度与前氮后移的施肥方法配合起来,有利于优质专用小麦生产。
3.5 地膜覆盖地膜覆盖栽培能使小麦产量大幅度提高,对品质的影响这方面研究还较少。
陕西省农科院小麦中心的初步研究表明,小麦覆膜后籽粒容重有不同程度提高;蛋白质含量与正常露地播种没有差异;覆膜不影响不同生态类型品种的干、湿面筋值和沉淀值;但不同生态类型品种之间籽粒容重、蛋白质含量、干、湿面筋值和沉淀值存在较大差异。
植物细胞转基因技术PPT课件
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优点：
➢ 适用范围广，不依赖组织培养人工再生植株；
➢ 可直接获得转基因种子，育种时间短，在鉴
定 时可直接针对目的性状的表现型来进行,简
单快 捷；
➢ 转化速度较快，变异性状稳定较快；
➢ 方法简单,不需要复杂昂贵的仪器设备。
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缺点：
➢转化受体受植物花期的限制，同时必须充分了
粒和 Ri质粒就成为植物基因转化的理想载体系统。
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➢T-DNA
T-DNA可以将其携带的外源基因整合到植 物基
因组中，T -DNA 上较重要的是 T 区两端左右 边
界各为 25bp 的重复序列。其中14bp 是中心, 分
10bp 和4bp 两组,是完全保守的。这两个边界 是
T -DNA 转移所必需的。其中尤以右边界最为 重
优点：
➢技术较成熟,转化效率高 ➢操作简单，不需要特殊仪器，培养周期短 ➢外源基因多以单拷贝或低拷贝插入受体细胞,稳
定性好，减少了共抑制等基因沉默现象。
➢可将较大片段DNA完整地转移到植物基因组中
等。
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缺点：
➢主要转化双子叶植物。 ➢T-DNA可以在植物染色体的任何区域内插入,
有可能导致有益基因的插入失活。
0.5nm),在显微镜下将外源DNA注射入植物细胞 或原生质体中的一种直接而完善的方法。
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➢该方法是Pena等1987年首创的,在用此方法进
行
基因导入时,通常需要把原生质体或培养的细 胞固
定在琼脂或低熔点的琼脂糖上,或用聚赖氨酸 处理
植物遗传转化方法和技术PPT课件
每外植体芽数 Shoots per explant
7 6 5 4 3 2 1 0
品种 variety
1.0mg/L 1.2mg/L 1.5mg/L 1.7mg/L 2.0mg/L
科 丰 6
科 丰 14
冀 豆 12
吉 林 35
铁 丰 29
无 腥 一 号 冀 黄 13
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到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、 果树花卉和林木等植物上获得转基因植株。
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2、操作步骤：
（1）制备DNA微弹； （2）准备靶外植体材料； （3）DNA微弹轰击； （4）培养轰击后的外植体．
immature embryos
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high osmotic media prepare calli
2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而 是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。
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3.原生质体再生系统
原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早 的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因 型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多 种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。
• 现将这三大类系统的载体、转化原理、转化方法和 受体细胞等归纳如图4-1。
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一、根癌农杆菌介导法
• 根癌农杆菌介导法的分子机制 • 农杆菌介导法需要具备的条件 • 农杆菌介导法的基本流程
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（一）根癌农杆菌介导法的分子机制
植物遗传转化的名词解释
植物遗传转化的名词解释植物遗传转化是一种创新性的生物技术手段，利用现代分子生物学和遗传学技术方法，将外源基因导入植物细胞或组织中，使其在遗传层面上发生改变和转化。
这一技术突破了传统育种手段的限制，可以快速地实现植物功能基因的扩增与转移，从而获得具有新的性状和特性的转基因植物。
植物遗传转化技术的基本原理是将外源基因通过特定的载体和转化方法导入植物细胞，然后利用植物细胞再生和组织培养的技术手段，通过筛选和鉴定获得转基因植物。
这一过程中，外源基因会在植物细胞中整合到染色体中，与宿主基因相互作用，从而改变植物的基因组和表型。
植物遗传转化技术的应用范围非常广泛。
首先，它可以用于植物抗病虫害的育种。
通过导入具有抗病虫害基因的外源基因，可以使植物获得抗性，减少使用农药的量，提高农作物的产量和质量。
其次，植物遗传转化技术可以用于植物的耐逆性改良。
通过导入耐旱、耐寒、耐盐等逆境胁迫基因，可以使植物在恶劣环境中更好地生长和发育。
此外，植物遗传转化还可以用于植物的品质改良，例如提高水稻的粮质、改善果实的营养含量等。
在植物遗传转化中，最常用的转化方法包括农杆菌介导的转化和基因枪法。
农杆菌介导的转化是将外源基因导入农杆菌中，然后利用农杆菌与植物细胞的基因组相容性，使其效应质粒转移至植物细胞。
基因枪法则是将外源基因以微粒金属或植物病毒颗粒的形式，通过加速装置射入植物细胞中。
在植物遗传转化中，关键的一步是选择适合的载体。
常用的载体包括质粒和病毒。
质粒是一种可以自我复制的遗传物质，通常由起始位点、启动子、终止子、选择标记基因和目的基因等组成。
而植物病毒则是利用其某些特性，将外源基因导入植物细胞。
近年来，随着基因编辑技术的出现和发展，植物遗传转化的技术手段也得到了进一步的改良。
基因编辑技术可以直接修饰植物基因组中的目的基因，而无需导入外源基因。
这一技术的出现，使得遗传转化更为高效、精确和安全。
尽管植物遗传转化技术在农业生产和植物科学研究中有着广泛的应用前景，但也引发了一些争议。
植物遗传转化(PPT-70)
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.3 胚性愈伤组织
愈伤组织的转化方法也适用于胚性愈伤组织。胚性愈伤组织的转 化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上获得成功。
芹 菜 胚 性 愈 伤 组 织 用 根 癌 农 杆 菌 C58C1 (pBZ6111) 感 染 后 ， 在 MS+2,4-D 1mg/L十KT0.1mg/L培养基上继代培养。在筛选到的氯霉素 抗性愈伤组织中检测到胭脂碱合成酶活性，表明外源基因已整合到 芹菜细胞基因组中并得到表达。抗性愈伤组织可在无激素的基本培 养基上增殖，但分化出的再生植株畸形(郑世学等，1996)。
பைடு நூலகம்
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.2 悬浮细胞
以悬浮细胞作受体的转化方法包括农杆菌介导法、基因枪法、 PEG介导法、电激法和显微注射法等。
小麦幼胚悬浮细胞用JQ-700基因枪法转化，得到了GUS基因瞬间表 达的各项最适参数。他们还建立了‘冀谷11号’谷子幼穗的悬浮培 养细胞系及植株再生体系。将胚性悬浮细胞系接种到MS培养基， 20d继代1次，直至出现绿芽点；然后转入无激素的MS0或1/2 MS0 培养基分化植株。以基因枪轰击转化悬浮细胞后，放置48h，检测 GUS短暂表达频率TTF％为20％-40%；在添加200mg/L卡那霉素 的MS培养基上，有5％-10％的愈伤组织具有抗性，且能稳定传代 (董云洲等，1998)。
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation）
转基因植物
第十三章转基因植物第一节转基因植物研究进展自20世纪80年代初首次成功获得转基因植物以来，植物遗传转化发展速度十分迅猛，基因工程技术日新月异。
在近20年时间内，已经有35个科的120多种植物转基因获得成功。
世界上有45个国家已经完成或正在进行转基因作物田间试验，已超过25 000例，涉及60种作物的10类经济性状的改造（雷茂良，1998）。
至今，全世界部分国家的大豆、玉米、棉花等农作物已经开始大量使用转基因技术。
转基因作物大规模生产并商品化是在1996年左右。
目前，发达国家转基因作物的种植面积比发展中国家要大得多，主要集中在美国、阿根廷、加拿大、澳大利亚和墨西哥，其中美国是世界上主要的转基因作物种植国。
2001年全球转基因作物种植面积已近5 260.6万公顷（其中美国转基因作物种植面积接近3/4），比2000年增加19%，比1996年转基因作物种植面积增加了30倍。
总之，转基因植物的种植面积一直呈上升趋势。
在美国，转基因作物现已成为其农作物的主流。
据估计，2002年，转基因玉米种植面积占美国玉米总种植面积的32%，转基因大豆种植面积占大豆总种植面积的74%，而转基因棉花种植面积已占棉花总种植面积的71%。
目前，全球转基因作物的种类主要有大豆、玉米、棉花和油菜等，这四类作物占全部转基因植物的86%，其中有75%种植在北美。
就转基因作物的性状而言，主要有抗除草剂、抗虫、抗病等几类。
世界上转基因作物种植面积较多的是抗除草剂大豆（占转基因植物总面积的40%）、抗虫玉米（占23%）、抗病烟草（占13%）、抗除草剂油菜（占10%）、抗虫棉花（占8%）、抗除草剂棉花（占3%）。
我国转基因植物的研究也在迅速发展，一些转基因植物也已商品化。
到2000年底，我国抗虫棉种植面积达37万公顷，减少农药用量达80%左右。
这与世界上主要发达国家如美国相比还有很大差距，但我国转基因方面研究的发展速度在加快。
第二节转基因在作物品种改良中的应用一、抗虫二、抗病毒三、抗病四、抗非生物胁迫五、抗除草剂六、改良作物品种七、改变花的颜色和形状八、转基因植株作为生物反应器第三节植物转基因方法自20世纪80年代初第一例转基因植物问世以来，分子生物学技术的进展推动了植物基因工程的飞速发展，目的基因的分离与克隆、转化手段的创新、检测方法的改进以及转基因表达与遗传稳定性的研究等都取得了重大突破。
植物遗传转化
从1986年首批转基因植物被批准进入田间试验
，至今国际上已有30个国家批准数千例转基因
植物进入田间试验，涉及的植物种类有40多种 。主要包括延熟番茄 , 抗除草剂的玉米、棉花 、大豆和油菜,抗虫的马铃薯、棉花和玉米,抗 病毒的西葫芦、南瓜和番木瓜 , 雄性不育的玉 米和莴苣 , 以及改变油脂特性的油菜和大豆等 。
。
优点： 不受宿主范围的限制 操作简便 成本底 缺点： 一般只适用于原生质体的转化，而原生质体 再生植株并不容易，转化效率低; 再生植株常不可育或形态异常、多拷贝插入等 现象。
• 花粉管通道法 利用开花植物授粉后形成的花粉管通道，直接将 外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或 早期胚胎细胞，实现目的基因的转化。 步骤： １）去除花冠; ２）用微量注射器从断面沿花柱中轴插入子房长度的约 １／４处，再退回２毫米左右; ３）注入含外源目的基因的缓冲液; ４）正常管理，收获种子, 经筛选获得转基因植株。
转基因块茎中花色苷含量分析
一种基于同源重组构建多基因双元载体的方法张兴国按目的基因导入位置细胞核叶绿体按启动子的类型组成型启动子特异性启动子遗传转化的主要方法农杆菌介导的遗传转化基因枪法电击法注射法化学药剂诱导转化花粉管通道法根癌农杆菌ti质粒转化系统外植体农杆菌共培养芽诱导抗生素筛选生根培养植株再生分子检测转基因植株获得技术特点
整合后外源基因结构变异小
操作简便等优点
该技术已成为转化成功最多的一种转化方法
• 基因枪法(particle gun) 又称微弹轰击法 (microprojectile bombardment或 particle bombardment) 。 该法借助高速运动的金属 粒子将附着于其表面的核 酸分子引入受体细胞，外 源基因进入受体细胞核后 整合到染色体组，然后通 过组织培养再生出完整个 体(植株)。
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一是利用小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细 胞或愈伤组织细胞，从而建立单倍体的基因转化受体系统；
二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如 花粉导人法、花粉粒浸泡法和子房微注射法等。
特点
A、利用单倍体遗传转化受体系统进行基因转化，避免了基因显隐性 的影响，有利于基因的充分表达，通过染色体加倍后即可使基因 纯合，缩短了目的基因纯合的时间，加快了转基因育种过程； B、花粉管通道法和子房注射法由于操作简单，受实验室条件限制较 小，已成为目前国内常用的转基因方法之一，同时，花粉管通道 法是利用植物自身的有性生殖过程，有利于将现代的分子育种与 常规育种紧密结合，也有利于目的基因在转基因后代中的稳定表 达； C、受体取材受到季节的影响大。利用花粉管通道法等进行遗传转化 只能在短暂的开花期内进行，这是限制该系统应用的主要原因之 一。
2、方法和步骤
（1）DNA微弹的制备 60~100mg金粉 1ml无水乙醇中， 超声波洗涤 离心去乙醇 1ml无菌水洗 涤2次后，加 1ml无菌水重悬 25l悬浮 液 +25l DNA（1 g/ l），混均，再加 入25l 2.5mol/L CaCl2，手指振荡5次， 加入20 l 40% PEG4000，手指振荡5次， 混合液在室温下静置10min 离心5min， 移去50-60 l 上清，其余混均，每次用 量8 l
（2）材料的准备，将材料接入培养皿中， 把培养皿放入基因枪的样品室中， 并对准子弹发射中轴。 （3）按基因枪操作程序进行微弹轰击 （4）轰击后材料的培养和鉴定
3、影响基因枪转化效率的因素
（1）金属微粒的种类和直径 （2）沉淀助溶剂 （3） DNA纯度和浓度 （4）轰击参数：粒子速度、入射速度、 阻挡板至样品室高度、轰击次数等 （5）植物受体系统
培养条件是影响高频再生系统的重要因素 影响组培的效果 影响变异频率
温度 光照：强度、光周期和光质Biblioteka 高频再生系统的评价
中间繁殖体诱导率 中间繁殖体增殖率 植株分化率 变异率 移栽成活率
③抗生素敏感性试验
选择对抗生素敏感的受体材料是建立高效稳定转基 因受体系统的保证（农杆菌介导法） 外植体 诱导培养基 含不同浓度抗生素培养基 植株再生 综合评价
化的细胞存活下来，而杀死未转化的细胞。
选择标记基因通常与目的基因置于同一质粒
载体。亦可将二者分置于不同质粒载体进行共转 化，如此便于在后代筛选出无标记基因的转化植 株。
报告基因
通常目的基因所编码的产物不易检测，在转化初期无法 判断该基因是否已导入植物。为此，可将一个易于检测产物的 基因与目的基因相连，共同转化植物，借助该基因的表达检测
三、植物遗传转化的方法
（1）载体转化系统：农杆菌介导法、植 物病毒载体法； （2）直接转化系统：化学法（PEG法和 脂质体法）和物理法（基因枪法、电击 法和显微注射法等）； （3）种质转化系统：花粉管通道法、萌 动种胚浸泡法、子房和胚囊注射法等。
(一）农杆菌介导转化法
1、根癌农杆菌介导转化原理 农杆菌能浸染植物细胞并将其中所带 有的质粒中一部分T-DNA导入植物细胞 中，并整合到植物核 DNA上，然后在植 物细胞中得到转录和翻译，表达出目的 基因的性状。
基因 来源 细菌
基因产物 β—葡萄糖苷 酸酶 荧光素酶
检测方法 荧光分析法及 组织化学分析 法 光分析法
选择性试剂
告
萤火 虫 水母
基
gfp
绿色荧光蛋白 基因 胭脂碱合成酶 基因 章鱼碱合成酶 基因 Glufosinate 抗 性基因 潮霉素磷酸转 移酶基因 新霉素磷酸转 移酶基因 草甘膦抗性 基因
叶盘转化法
打孔器从消毒叶片上获得叶盘 在工程菌液中浸数秒
培养基上共培养2~3天
在含有抑菌剂的培养基上培养 转化体选择和再生
不同作物适宜的接种时间和接种菌液浓度*
外植体种类
小麦未成熟胚和 胚性愈伤组织 水稻胚性愈伤组 织 玉米未成熟胚 棉花下胚轴 大豆子叶
接种时间 /min
接种菌液浓度 /OD
60 15 10 1～3 10～30
题——筛选 ( screening ).
同时，即使在非常严格的筛选条件下再生的 转化体也仍可能存在假转化体 ( 或交叉保护的逃 脱体escapee), 所以必须对转化体（transformants
）进行严格的鉴定，以确证其为转基因植株（
transgenic plant）
1、 转化体的筛选
利用选择标记基因，借助一定的手段使已转
4、遗传转化受体系统的建立
（1）高频再生系统的建立 ①理想的高频再生系统应具备的条件
具有高的中间繁殖体的诱导率
具有高的植株再生能力 易培养，重复性好 体细胞无性系变异少
②高频再生系统建立的方法
高频再生系统的建立是建立高效稳定转基因受体系统的 基础
●外植体的选择
外植体的生理年龄
外植体的生理状态
外植体的遗传背景 选择的适宜外植体是建立高频再生系统的前提
内
容
一、 植物遗传转化系统概述 二、植物遗传转化受体系统的建立 三、 植物基因转化的方法 四、转基因植株的再生及其检测
一、 植物遗传转化系统概述
(general situation of plant genetic transformation system)
1、植物遗传转化（plant genetic transformation）是指利用重组 DNA技术，将外源基因导入植物 细胞，外源基因与受体植物染色 体整合并稳定遗传和表达的过程 或技术。 植物遗传转化技术是分子育种 的核心技术之一，已经成为培育 植物新品种的有效方法之一.
（3）原生质体受体系统
●以原生质体为受体材料，然后通过原生质体培 养获得再生植株的受体系统。
●特点： ■转化率高 ■获得再生植株无性系变异多，转化的外源基因 稳定性差 ■出现的嵌合体少 ■技术难度大
（4）生殖细胞受体系统
以生殖细胞如花粉和卵细胞为受体进行基因转化的系统 称之为生殖细胞受体系统，也叫种质系统。利用生殖细胞进 行基因转化有两种途径：
●培养基
培养基的筛选是高频再生系统的核心
培养基影响组培效果 培养基影响变异程度 培养基影响分化途径
●培养基
◆基本培养基 ◆激素的选择： 生长素（2，4-D、NAA、 IAA、IBA和2，4，5-T）和 细胞分裂素（ ZT、BAP、6-BA、2iP和 KT） ◆糖的种类和浓度 ◆有机附加物的选择
●培养条件
0.5～1.0 1.0～1.5 1.0 0.3～0.6 0.3～0.6
共培养时间 （ d） 2～3 2 2～3 2 2
原生质体共培养转化法
原生质体分离 原生质体培养 共培养2~3天（工程菌：原生质体=1：1000） 去菌培养和转化体的选择 植株再生
3、影响农杆菌介导法转化效率的因素
（1）农杆菌 （2）质粒 （3）受体材料 （4）共培养：时间、培养基和培养条件 （5）抗氧化剂
10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 1996 1997 1998 1999 2000 2001
年份
面积(万公顷)
2002
2003
2004
2005
全球转基因作物种植面积
1、怎样开展遗传转化工作
确定育种目标 获得目的基因 工程载体的构建 受体材料的选择 遗传转化受体系统的建立
基因枪转化法的特点
不受基因型限制，并且可用各种组 织或细胞作为靶材料
操作简便 外源基因随机整合，并且常常是多 拷贝整合，因而易造成转基因沉默 和转基因后代目的基因分离复杂化 与农杆菌转化法相比，其转化效率 还较低
四、转基因植株的再生及其检测
由于转化事件总是发生在少数细胞内，这就 带来了如何富集转化细胞而淘汰未转化细胞的问
植物遗传转化受体系统的建立是 基因工程的重要环节
1、植物遗传转化常用的受体 （1） 植物组织和器官：幼叶、未成熟 子叶、子叶、未成熟胚、成熟胚、子叶 节、子房、下胚轴、茎尖、花粉、球茎、 根和鳞茎等。
（2）中间繁殖体：
在离体培养过程中 形成的具有一定形 态结构的中间繁殖 材料。包括：原球 茎、根状茎、丛芽、 胚状体、愈伤组织 和悬浮细胞等。
2、根癌农杆菌Ti质粒转化的基本程序
（1）受体系统的 建立 （2）Ti质粒转化 载体的构建 （3）目的基因 的转化与鉴定
目的基因的转化程序
根癌农杆菌的培养、纯化、保存
Vir区基因的活化和工程菌液的制备 外植体的预培养、接种及与农杆菌的共培养 外植体脱菌及选择培养 转化体的选择和植株再生
转基因植株的鉴定
④农杆菌敏感性试验
选择对农杆菌敏感的受体材料是建立高效稳定转基因
受体系统的关键（农杆菌介导法）
不同植物材料
农杆菌菌株浸染 敏感性评价 （结瘤或发根率，发生时间，生长状况等）
（2）受体系统常见的问题及其解决途径
①再生能力及其遗传稳定性 选择合适外植体 减少继代次数 选择合适培养基等 ②愈伤组织褐变 ③再生植株玻璃化
采用一定的方法将目的基因导入细胞 转化细胞的筛选和植株再生 转基因植株鉴定和目标性状鉴定
二、植物遗传转化受体系统的建立
植物遗传转化受体系统是指用于 转化的外植体通过组织培养途径 或其他非组织培养途径，能高效、 稳定地再生无性系，并接受外源 基因的整合，对用于转化选择的 抗生素敏感的系统（王关林和方 宏筠，1998）
（3）原生质体
2、植物基因转化受体的条件 ●高效稳定的再生能力 ●较高的遗传稳定性 ●具有稳定的来源 ●对抗生素敏感 抑菌抗生素：在农杆菌介导的遗传转化 中用来抑制农杆菌生长的抗生素。 选择性抗生素：用来对转化子进行早 期筛选的抗生素
作为选择性抗生素的条件
■植物材料对所选用的抗生素有一定的敏感性