[医学]第二章 生物制药技术与单元操作

链延伸 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
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5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
变性 3’TAGCGCTATCGCATCGACGCT聚D合NA酶 GGAUCG 5‘
退火
5‘AUCGCG聚D合NAA酶TAGCGTAGCTGCGAGGATCG
3’
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基因工程技术上三个重要成果
1.基因工程的工具酶
1966年，发现了DNA连接酶。1970年Smith和Wilcox在流感嗜 血杆菌中分离并纯化了限制性内切酶 Hiwenku.baidu.comd Ш，使DNA分子 的切割成为可能。1979年，Bltimore和Temin领导的两个研 究小组分别在各自的工作中发现了逆转录酶。
2.基因工程载体
根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其 核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的 基因。 3.从mRNA合成cDNA 采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶 催化合成其互补DNA（cDNA） 4．从基因文库中筛选 5．利用PCR合成＊
基 因 组 文 库
2.cDNA文库
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核酸的电泳分离技术
表 琼脂糖浓度与DNA分离范围
琼脂糖凝胶电泳的操作过程
荧光染料EB染色的原理
EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐 (EthidiumBromide)。EB是一种扁平分子，它可 以嵌入核酸双链配对碱基或碱基对之间，在紫 外线激发下，发出红橙色荧光。
激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸 吸收254nm的紫外线后将能量传递给EB，二是 EB本身吸收302nm和360nm的紫外线的能量。 这两方面的能量最终激发EB发射波长为590nm 的可见光（红橙区）。
2.1.2 基因克隆的酶学基础
限制性核酸内切酶(restriction ednonuclease)
第二章 生物制药技术与单元操作
2.1 基因工程技术
基因工程技术，又称DNA重组技术。通过基因 工程技术操作，可以将外源DNA通过载体引入 其它物种的细胞，赋予宿主细胞新的遗传特性 或产生该宿主原来并不产生的新代谢物，并能 遗传该特性。
基因工程的原理是选择合适的外源目标DNA， 然后通过体外操作将其整合到载体上，通过载 体转入宿主细胞，并成功地在宿主细胞内稳定 遗传和高效表达。
4.基因载体 也称克隆载体。这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现 外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些 DNA分子。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻 译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆 载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。
二、基因工程的基本操作程序
PCR技术基本步骤 • DNA的复制
变性
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ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 退火 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
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热变性
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5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
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变性
GGAUCG 引物5‘酶
引物
退火
引物
5‘AUCGCG 引物酶
以生物体的RNA序列为模板，经反转录形成cDNA分子，再予 以克隆。由于用以克隆的cDNA分子通常只有几个kb大小， 所以很适合用质粒作载体。 构建cDNA文库的程序：（1）制备含有polyA的RNA；（2） cDNA的合成；（3）cDNA与载体的连接；（4）转化。 cDNA与载体分子形成重组分子后，转入受体菌株（如大肠杆 菌），当不同的重组分子含有不同的基因时，整个转化子含 有来自mRNA群体的各种cDNA基因，这个转化子群体构成了 该mRNA全部遗传信息的cDNA基因文库。
1972年，美国斯坦福大学博格（Berg）研究小组利用限制性内 切酶EcoR I 和T4 DNA连接酶成功地进行了首例体外基因重组 实验。
1973年，科恩（Cohen） 等人用EcoR I内切酶处理 大肠杆菌的抗四环素和抗 青霉素及磺胺的质粒，并 连接成一个新的重组质粒。 将这种工程化的质粒转入 到大肠杆菌中，在含有四 环素和青霉素的平板中筛 选到了重组菌落。
基因工程的基本操作程序应包括： 目的基因的获取； 目的基因与载体DNA体外重组； 重组DNA分子导入受体细胞； 筛选并鉴定无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）； 外源基因的表达。
（一）、目的基因的获取
1．直接从染色体DNA中分离： 仅适用于原核生物基因的分离，较少采用 2．人工合成
为了使DNA片段能在宿主细胞中得以扩增，须将其接到一个特 定能够进行自我复制的载体分子上。Lederberg开始从事细菌 性因子（F）因子的研究。20世纪50到60年代年代，相继发现 其他质粒，如抗药性基因（R因子）和大肠杆菌因子（Col）。 这些工作为基因工程载体系统的建立打下基础。
3.基因的体外重组技术
同年，加利福尼亚的博耶 （Boyer）也进行了类似 的实验。
重组子转化的成功标志着 基因工程的诞生。
三、基因工程的研究内容
基因工程（genetic engineering）是指在基因 水平上，采用与工程设计十分类似的方法， 按照人 类的需要进行设计，然后按设计方案创建出具有某 种新的性状的生物新品系，并能使 之稳定地遗传给 后代。
1.限制性核酸内切酶的概念
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核 苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水 解酶。
2.1.1 基因工程的操作程序
一、基因工程的相关概念
1.克隆与克隆化 克隆指同一副本或拷贝集合。从众多不同的分子群体中分离 的某一感兴趣分子，经扩增产生很多相同分子集合，即为分 子克隆。
2.DNA克隆 在体外外来遗传物质与载体DNA结合成具自我复制的DNA分子， 通过转化或转染宿主细胞、筛选出转化子细胞，再扩增提取 获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。 3.目的基因 有时应用重组DNA技术的分离、获得某一感兴趣的基因或DNA 序列，有时是为获得感兴趣基因的表达产物－蛋白质。