(优选)实验二细菌的革兰氏染色及芽孢染色法

涂片固定 结晶紫初染
• G¯肽聚糖层较薄，交联度低，
含较多类脂质，故用乙醇处理后， 类脂质被溶解，细胞壁孔径变大， 通透性增加，使初染的结晶紫和 碘的复合物易于渗出，细胞被脱 色，经沙黄复染呈红色。
碘液媒染 乙醇脱色 番红复染
（二）实验原理——芽孢染色法原理
芽孢（内生孢子）及其研究芽孢的重要性 ➢ 芽孢是某些G+菌形成的圆形或椭圆形的休眠体，抗热
性和折光性较强。 ➢ 芽孢的大小、形态、位置可做分类依据。
中央芽孢
末端芽孢
偏端芽孢
游离芽孢
（二）实验原理——芽孢染色法原理
➢ 芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难； ➢ 但当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行
染色时，染料可进入菌体和芽孢； ➢ 进入菌体的染料经水洗后可被脱色； ➢ 当用对比度大、浅色的复染色剂（番红）染色后，
滴加数滴番红染 液在菌膜上，染 色2min
不要直接冲菌膜
（四）实验步骤——芽孢染色
蜡状芽孢杆菌（B.cer）
1、制备菌液：加2滴蒸馏水于1.5ml离心管中，用接种环从斜面 挑取菌体2-3环于离心管中充分混匀。（2人一组） 2、染色：加孔雀绿2-3滴于小试管中。 3、加热：沸水浴，15-20分钟。 4、涂片：用接种环从小试管中取一环菌涂于一干净载玻片上，制 成涂片。 5、干燥、火焰固定 6、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。
红； ➢ 芽孢染色液：5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液 ； ➢ 二甲苯、香柏油 。 3、器材： ➢ 载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、显微镜。
（四）实验步骤——革兰氏染色
1.细菌涂片标本的制作
（1）涂片 载玻片1张，加1滴生理盐水，取菌研磨均匀。 （2）干燥 室温干燥，或置酒精灯高处慢慢烘烤。 （3）固定 干燥后的涂片，在酒精灯火焰中通过3次。
7、复染：加番红水溶液染色2-3分钟，水洗，吸水纸吸干。
８、镜检：10x ，40x 、100X（油镜）观察。绘图
（二）实验原理——革兰氏染色原理
• 革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G—）两大类，该染色法所以能将细菌 分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的 不同所决定的。
革兰阳性菌细胞壁的化学组成
N-乙酰胞壁酸
下检查。
革兰阳性菌（G+）， 被染成蓝紫色。
革兰阴性菌（G-）， 被染成红色。
实验程序Ⅰ（革兰氏染色的方法和步骤）
每人取大肠杆菌和枯草杆菌，做一块混合涂片，进行革兰氏染色。
蒸 馏 水
涂片
干
涂 片
燥 固 定
自然干燥
固定
2分钟
结 晶 紫
干燥 镜检
复染 2min
水洗
3分钟
番 红
脱色 20~30s
水洗
1分钟
（四）实验步骤——革兰氏染色
2.革兰法染色
（1）初染 结 晶 紫 2min 细水冲洗 甩去积水 （2）媒染 卢戈碘液 1min 细水冲洗 甩去积水 （3）脱色 95%乙醇 20-30s 细水冲洗 甩去积水 （4）复染 番红 3min 细水冲洗 甩去积水
（四）实验步骤——革兰氏染色
3.观察实验结果 待标本自干或用吸水纸吸干后，置显微镜
（四）实验步骤——芽孢染色
改良的Schaeffer-Fulton氏染色法
❖制备菌悬液 ❖染色 ❖涂片固定 ❖脱色 ❖复染 ❖镜检
芽孢染色---制备菌悬液
1、滴生理盐水 生理盐水
2、制备菌悬液 挑取2-3环菌苔
在EP管中滴2 滴生理盐水
与生理盐水混匀
芽孢染色---染色
1、滴加孔雀绿染液 5%孔雀绿染液
革兰氏染色注意事项
• 涂片时，滴生理盐水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌 膜宜薄；
• 酒精脱色：是革兰氏染色成败的关键，要求脱至流出的乙醇不 带颜色为止，立即水洗。若脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌， 脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌。
• 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后（冲反面），应吸去 玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
初染 1min、
95%
碘
后水 洗
乙醇
媒染
液
1min
水洗
水洗时不要直接冲菌膜
（四）实验步骤——革兰氏染色
取一干净载玻片→→在两端各加一滴生理盐水→→无 菌操作取菌种→→涂于生理盐水中（成菌膜） →→自 然干燥→→火焰固定→→初染（结晶紫，2min） →→水洗→→媒染（碘液，1min） →→水洗→→脱 色（乙醇，20-30s） →→水洗→→复染（蕃红， 3min） →→水洗→→自然干燥→→观察。
2、加热染色
在离心管中滴2-3 滴孔雀绿染液
沸水浴加热 15-20min
芽孢染色---涂片固定
1、滴菌悬液
经孔雀绿染 色细菌悬液
2、涂片
用接种环 均匀涂布
3、干燥
4、固定
室温自然晾干
通过酒精灯 火焰3次固定
接种环取菌悬液 在载玻片中央
芽孢染色---复 染
1、滴番红水溶液 0.5%番红水溶液
2、水洗
（优选）实验二细菌的革兰氏 染色及芽孢染色法
细菌的染色
细菌 个体 微小
半透 明
显微镜
未 染色
细菌 大致 形态 大小
单染色法 复染色法
能看清形态大小 但是无鉴别意义
能看清形态大小 又有鉴别意义
（一）实验目的：
• 1、学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。 • 2、巩固显微镜油镜的使用技术和无菌操作技术。
芽孢仍保留初染剂的颜色（绿色），而菌体呈复染 剂颜色（红色）。
（三）实验器材
1、活材料： ➢ 革兰氏染色：培养12h-16h枯草杆菌（Bacillus subtilis）
和培养24h大肠杆菌（Escherichia coli） ➢ 芽孢染色：培养28-36 小时 的蜡状芽孢杆菌（Bacillus
thuringiensis） 2、染色液和试剂： ➢ 革兰氏染色染色液：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃
N-乙酰葡萄糖胺
四肽链 五肽桥
β-1,4糖苷键
肽聚糖（15-50层）
细胞膜（双层脂质 蛋白嵌镶）
脂质
蛋白质
革兰阴性菌细胞壁的化学组成
脂蛋白
脂质双层 脂多糖
蛋白质
外膜 肽聚糖（1-3层） 细胞膜 脂质
（二）实验原理——革兰氏染色原理
• G+菌细胞壁较厚，肽聚糖wenku.baidu.com量较
高，网格结构紧密，含脂量低， 当被酒精脱色时，引起了细胞壁 肽聚糖层网状结构的孔径缩小以 至关闭，从而阻止了不溶性结晶 紫-碘复合物的逸出，还是原来的 颜色。