实验二：叶绿体的分离与荧光观察_

淬灭剂）.
细胞生物学实验
实验用品
材料： 菠菜叶片
试剂：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙 (AO)
配制方法：称取0.1g吖啶橙加蒸馏水100ml做干液，放冰 箱备用，临用前取1ml干液加1/15mol/L磷酸缓冲液 （pH4.8）9ml。
仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜， 显微镜，镊子，培养皿，纸，移液管，滴管，烧杯，无 荧光载片，盖玻片，离心管,吸水纸等
荧光显微镜的 特点：
1.两组光源:透射照明光 源(卤素灯)；荧光光源 (超高压直流汞灯或氙 灯)；
2.有特殊的滤光片:激发 滤色片和阻断滤片 3.激发光波长：较短， 因此，分辨力高于普通 紫外光(UV)：激发光谱区域：330-400nm; 紫光(V)：激发光谱区域：395-415nm; 显微镜； 4.荧光光源照明方式： 通常为落射式。
r=8cm n=15,000rpm
为了便于进行转速和相对离心力之 间的换算，人们在此公式的基础上 制作了离心力的列线图。见图2. 先在离心机半径标尺上取已知的离 心半径和在转速标尺上取已知的转 速，然后在这两点间取一条直线， 与中间RCF标尺上的交叉点，即为 相应的相对离心力数值，也是 文献中常用的×g。
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实验步骤
菠菜叶片(去叶脉)3g → 0.35mol/L氯化钠15ml→研磨 (冰浴)→匀浆过滤(2层尼龙网)→滤液在1000rpm离心 2min→弃沉淀，上清液3000rpm离心5min →去上清液 →沉淀为叶绿体(混有部分细胞核)，用0.35mol/L氯化钠 溶液悬浮 →滴片观察 取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用分别用普通 光学显微镜观察叶绿体的形态结构和荧光显微镜观察自发 荧光 将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上,再滴加1滴0.01%吖啶 橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片,使用荧光显微镜观察间 接荧光 取叶表皮临时装片荧光染色观察
离心介质的主要作用 分辨率范围
离心后区带形成位置
影响样品区带形成的主要因素 一般操作方法
易变(样品易扩散）
不变（样品不扩散）
离心时间（过长或过短都 颗粒样品密度 不利） 介质梯度应预先形成 ， 离心前将样品小心铺放在 密度梯度溶液表面，离心 后形成区带。 蔗糖、甘油 介质梯度不需预先制备，离心时把 密度均一的介质液和样品混合后装 入离心管，通过离心自形成梯度， 让颗粒在梯度中进行再分配。 蔗糖 、甘油、 CsCl、硫酸铯、溴 化铯、三碘苯衍生物等。
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实验二 叶绿体的分离与荧光观察
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实验目的
1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细
胞器分离的一般原理和方法。 2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光， 并熟悉荧光显微镜的使用方法。
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实验原理
细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细 胞和细胞组分的分离 在等渗溶液中进行组织匀浆、分离 叶绿体的分离采用差速离心或密度梯度离心法 进行 利用荧光显微镜观察叶绿体的自发荧光和间接 荧光（次生/诱发荧光）
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实验结果
普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，在高 倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒， 即基粒。 荧光显微镜下，选用蓝色激发滤光片，叶绿体自 发荧光为火红色，间接荧光为桔红色。细胞核呈 黄绿色。
图：叶绿体自发荧光为火红色
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注意事项
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠)中进行,以免 渗透压的改变使叶绿体受到损伤。 分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅 速分离和观察。 离心机使用：离心管要平衡 荧光显微镜使用
荧光显微镜检要在光线尽量暗的环境下进行 使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发光源，保护眼睛 凡是荧光染料都有一定毒性，请做好防护 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的 影响，如温度、光、淬灭剂等 在荧光观察时应抓紧时间,有必要时立即拍照。 在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。 汞灯开启后15min内不要关闭
RCF≈20,000×g
图2:离心力与离心机转数的转换列线图
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来自百度文库
荧光
荧光显微镜观察荧光现象：
某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下 吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能 在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如 可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光 现象立即停止。 有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出 荧光,称为自发荧光。如叶绿素的火红色荧光。 有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后 同样也能发出荧光，称为间接荧光。如叶绿体吸附 吖啶橙后可发橘红色荧光。
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各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数
看图思考：要将细胞匀 浆液中的得到更纯的分 离，选用哪种离心方法 较好？(线粒体:1.18g/ml、 溶酶体:1.12g/ml、微 体:1.23g/ml)
根据1924年Svedberg（离心法创 始人--瑞典蛋白质化学家）对沉降 系数下的定义：颗粒在单位离心力 场中粒子移动的速度。以每单位重 力的沉降时间表示，并且通常为1～ 200×10-13秒范围，10-13这个 因子叫做沉降单位S,即1S=10-13秒 图:各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数
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实验报告
记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光 和次生荧光现象，并分析结果，解释叶绿 体发出的自发荧光和次生荧光的作用机理 有何不同？
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思考题
1.分离叶绿体实验的原理是什么？操作 过程中应注意什么？ 2.普通光学显微镜和荧光显微镜的原理 有何异同点？ 什么叫离心力和转速，两者之间的关系 如何？ 什么叫沉降系数，其单位用什么表示， 如何定义
常用介质
表1:各种亚细胞构造在不同的离心介质中分离所需的离心力与时间
结构 细胞核 线粒体 溶酶体 质膜(大片) 内质网片段 微粒体 小颗粒 差速离心 (在0.25M蔗糖溶液中) 800-1000g ×10min 10,000g×20min 10,000g×20min 100,000g×15min 150,000g×40min 100,000g×60min 100,000g×60min 速率-区带梯度离心 (5 ～50%蔗糖) 500g ×10min 5000g ×10min 5000g ×10min ～100,000g×100min 1000g×20min 10,000g×30min 等密度离心 (其他介质,如CsCl等) 4000g ×60min 80000g×100min 80000g×100min ～ 150,000g×600min 100,000g×200min 100,000g×360min
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密度梯度离心
用一定的介质在离心管内形成一连续或 不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬 或置于介质的顶部，通过重力或离心力 场的作用使细胞器分层、分离的方法。 这类分离又可分为速率-区带梯度离心和 等密度梯度离心两种。 优点是一次离心可分离提纯样品中几种 组份，用于较精细的分离。
速率-区带梯度离心和等密度梯度离心
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离心分离技术
离心是分离细胞组分和生物大分子最常用的分 离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体 积和密度，可在不同离心力不同介质沉降分离。 分离各种细胞组分的方法主要有： 差速离心 密度梯度离心 速率-区带梯度离心 等密度离心
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差速离心
主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起 始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬 浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将 较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。 差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子 不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取
成本
适中 便宜 昂贵 便宜 便宜 昂贵 适中 便宜
举例
动植物组织或细胞 植物组织 细胞悬浮液小规模处理 细胞悬浮液和植物细胞 大规模处理 血红细胞的破坏 动植物细胞 破碎大肠杆菌 甲苯破碎酵母细胞
机 械 法
化 学 法
渗透冲击 酶消化法 增溶法 脂溶法
碱处理法
碱的皂化作用使细胞 壁溶解
剧烈
便宜
破碎大肠杆菌
常用的细胞破碎方法
方 法 技术
匀浆法 研磨法 超声波法 珠磨破碎法
原理
细胞被搅拌器劈碎或 受剪切力而破碎 细胞被研磨物磨碎 用超声波的空穴作用 使细胞破碎 细胞被玻璃珠或铁珠 捣碎 渗透压破坏细胞 细胞壁或细胞膜被消 化，使细胞破碎 表面活性剂溶解细胞 膜 有机溶剂溶解细胞壁
效 果
适中 适中 剧烈 剧烈 温和 温和 温和 适中
加入吖啶橙后叶绿体的自发荧光（火红色）消 失了？ 原因：是荧光淬灭现象所致。吖啶橙是一种芳 香杂环阳离子型染料，可透过细胞膜，因此而 推测吖啶橙阳离子是进入叶绿体膜内通过影响 叶绿素分子的结构或所处的化学环境使自发荧 光淬灭的。
荧光淬灭：在产生荧光的物质的溶液中加入盐等物质会使 溶液的吸光度下降而荧光强度变小的现象。 荧光淬灭现象产生原因：分子结构和化学环境是影响物质 发射荧光和荧光强度的重要因素（pH、温度、光、
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A、速率-区带梯度离心流程图
B、等密度梯度离心流程图
原理：根据分离的粒子在梯 度液中沉降速度的不同，通 过离心力场的作用，使不同 的颗粒在密度梯度层内形成 一系列区带，从而达到彼此 分离的方法。
原理：根据不同颗粒在密度梯度 介质中存在着浮力密度差，在离 心力场作用下，颗粒或向下沉降， 或向上浮起，一直移动到与它们 各自的密度恰好相等的位置上形 成区带，从而使不同浮力密度的 颗粒得到分离的方法。
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离心力与离心机转速转换公式：
RCF＝1.118×10-5×r×(n)２ (×g)
式中,RCF表示相对离心力,单位是重力加速 度g（980厘米/秒2）, (×g)表示重力加速 度的倍数,r 为离心转子的半径距离，指离心 管的重心至转轴中心间的距离，单位为厘米；
n为转子每分钟的转数（rpm）。
蓝光(B)：激发光谱区域：420-485nm; 绿光(G)：激发光谱区域：460-550nm ；
图：落射式荧光显微镜的光路
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荧光染料:吖啶橙(acridine orange )
吖啶橙是一种与DNA和RNA都能结合的荧光染料 在紫外光或蓝光(330～485nm)激发下，DNA可被激发 出530nm的荧光发射峰(细胞核发亮绿色荧光)，RNA 可被激发出640nm的荧光发射峰(核仁和胞质RNA发桔 红色荧光)。 产生两种不同荧光是由于吖啶橙与双链DNA 和单链 DNA或RNA的结合方式和结合量不同而决定的。DNA 是高度聚合物，它与DNA结合是潜入双链之间，结合 量相对少；而与单链DNA或RNA的结合则由静电吸引 堆积在磷酸根上，结合量相对多些。 我们推测，叶绿体的次生荧光的来由，大部分来自叶 绿体的吸附作用，极少部分来自叶绿体中的RNA.
两种密度梯度离心方法的异同
特 点
分离方法的主要依据 介质密度梯度选择
速率-区带梯度离心
主要依赖分离的粒子在梯 度液中沉降速度的不同
等密度离心
依赖于样品颗粒的不同密度来进行 离心分离的
最大密度必须小于样品中 覆盖了待分离物质的密度；梯度陡 粒子的最小密度；梯度平 度较高 缓 减缓颗粒扩散速度 沉降系数相差～20%的物 质 阻止颗粒移动；筛选与分离颗粒 颗粒密度差异大于1%