志贺氏菌检验

1
宋内氏典型菌落
XLD
志 显
2
福氏典型菌落
XLD
志显
3
鲍氏典型菌落
XLD
志显
4
痢疾典型菌落
XLD
志显
5
熟肉制品中宋内的分离效果
R&F志显
XLD
6
蔬菜制品中宋内分离效果
XLD
志显
7
鲍氏在生肉中的分离效果
XLD
志显
8
熟肉制品中福氏的分离效果
志 显
（四）初 步 生 化
• 选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种TSI、葡萄糖 半固体、营养琼脂斜面，36 ℃1 ℃培养20 h～24 h， 观察结果。 • 培养物中出现以下情况可以弃去 a.在三糖铁琼脂斜面上蔓延生长 b.发酵乳糖或蔗糖 c.不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的 d.产气的 e.产生硫化氢 f.有动力的培养物
菌 落 特 征
• MAC琼脂 ：无色至浅粉红色， 半透明、光滑、 湿润、圆形、 边缘整齐或不齐，直径2～3 mm • XLD琼脂 ：粉红色至无色，半 透明、光滑、 湿润、圆形、边缘整齐或不齐， 直径1 ～2 mm
R&F志贺氏菌显色琼脂 ：白色，不透明、圆形、 边缘不整齐，直径1 mm～3 mm，菌落周围琼脂 颜色变为紫红色
GB/T 4789.5-2003 标准不足处
1. 采用GN增菌肉汤,37℃需氧培养,4小时后
大肠菌的生长速度大大超过志贺氏菌, 检测
效果较差
2. 使用的分离平板SS对志贺1型有抑制
3. 检验方法与现行的其它国家的标准存在差
异
增菌：用GN增菌液使 处于濒死状态的细菌 恢复活力
选择性平板分离培养： XLD+MAC/显色培 养基
尽可能简化；生化反应方面亦尽量沿用原标准中的方法
2.与国际接轨的原则
该标准的起草内容主要参考了国际标准组织ISO标准 ，
部分参考采用了美国FDA、NMKL等标准
3.与现有已颁布的新版国家标准协调 统一
参考了已颁布的2008版国标，在样品 的前处理步骤，培养条件的选择，文字 描述等方面尽量 保持一致。
大肠埃希氏菌 1, 120. 149 164. 88，159. 130 121 38, 23 . 144 29 3 1,2,13,16,17,19, 62,69,73,3438-51 2, (50) 87ab,, 96 85 149 76 102 105ac 7 28ac, 98 83 47 124 29, 可能
初步生化:三糖铁（TSI）
现象 说 明 黄色 红色或 不变色 黑色 葡萄糖阳性 葡萄糖阴性
底层
产H2S
气泡
黄色 斜面 红色或 不变色
产气
乳糖和（或）蔗糖阳性 乳糖和（或）蔗糖阴性
志贺氏菌都能分解葡萄糖， 产酸不产气，大多不发酵 乳糖，不产生H2S。 如图 中2号管的反应.
志贺氏菌属四个群的生化特征
• 每年均有志贺菌感染暴发的报告，每次暴 发的发病人数在数十人到上千人不等。多 数由于食物和饮水污染引起。 • 1994年5月11日，江苏省无锡市发生一起26 所小学的学生因课间餐食用豆奶导致1345 人食物中毒的事故，后经调查是一起志贺 菌和致病性大肠杆菌混合感染引起的食物 中毒，此次爆发波及范围之大，发病人数 之多，在我国历史上颇为少见。
志贺氏菌的检验
一、流行病学简介
• 一种古老的肠道传染性腹泻。19世纪曾出现全世 界菌痢的大流行。 • 1899年，日本人志贺氏首先发现菌痢是由痢疾杆 菌引起。 • 第一次世界大战期间（1914-1918年），德国死 于痢疾者约4万余人，并进一步证实痢疾杆菌是 菌痢流行的病原。
• 细菌性痢疾历年来一直是我国夏秋季发病 率最高的肠道传染病。 • 近年来报道非洲及中美洲流行的痢疾志贺 菌病死率达5%-15%。 • 我国属发展中国家，人民的生活条件虽然 在不断改善，但由于部分地区卫生知识普 及不够，食品卫生管理、监督不力，使得 志贺菌的感染在我国传染病中多年来一直 处于较高的地位。
μg/mL ） NMKL：志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5 μg/mL ）
培养条件：41.5℃±1℃ 厌氧培养 原国标： 37℃需氧培养 ISO： 41.5℃厌氧培养 FDA： 42℃（除宋内其他志贺菌) 和44℃（宋内）厌氧培养 NMKL： 42℃厌氧培养
分离用平板
原国标：HE或SS; MAC或EMB ISO： MAC、 XLD 、 HE FDA： MAC NMKL： MAC、 XLD 、 HE
（一）增 菌 培 养
用志贺氏菌增菌液增菌, 41.5 ℃±１℃，16 h～20 h厌氧培养。
智能厌氧微需氧培养系统
（二）分 离 培 养
• 取增菌后的GN增菌液或志贺氏增菌肉汤分 别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板 或R&F志贺氏菌显色培养基平板上 • 于36 ℃1 ℃培养20 h～24 h，观察各个 平板上生长的菌落形态 • 若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察， 则继续培养至48 h再进行观察。
O抗原部分相同的:
大肠埃希氏菌
。124 3588-51 58 152 147ab 5444-80 135 129 149 53 。112ac
志贺氏菌属 A2 A3 A4 A5 A12 (3341-55) B2b B3a B4b B5 C1 C4 C5 C7 C8 C11 C14 C15
志贺氏菌属 A1 A2 A3 A4 A6 A7 A8 A10 A11 A12 B群 C1 C2 C3 C4 C6 C9 C10 C12 C13 C15 C16 C17 C18
二、生物学特性
• （一）、形态与染色 • 革兰氏阴性短杆菌、无荚膜，无芽胞，无 鞭毛 • • 2~3um*0.5~0.7um
（二）百度文库培养特性
1 、 需 氧 或 兼 氧 性 厌 氧 ， 最 适 温 度 37℃ ， PH7.2~7.4 2、在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、 光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、在中等大小 的菌落 3、宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁 平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落呈玫瑰红色。 4、在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。
79 4838-69 143 105ab 32 112ab
结果报告
• 综合以上生化试验和血清学鉴定的结果， 报告25 g（mL）样品中检出或未检出志贺 氏菌属。
菌体（0）抗原 • 1.型特异性抗原：化学组成为多糖，是光滑型菌株所 含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时，此抗原也常 随之消失，根据所含的型抗原不同，可将志贺菌属分 为A、B、C、D四个群及39个抗原型。 • 2.群特异性抗原：为光滑型菌株的次要抗原，也是菌 体抗原的一种。特异性较低，主要存在于B群。根据所 含的群抗原不同，可将一些菌型分为多种亚型。
（五）生化鉴定
• 增加了API 20E诊断试剂条和全自动细菌生 化鉴定仪VITEK；
（六）血清学鉴定
1.抗原的准备 志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。 抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗原 结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。 O抗原为糖脂蛋白复合物，可分为型特异 性抗原和群特异性抗原。志贺氏菌分为4个群， 48个血清型（包括亚型及变种）。K抗原在志 贺菌属分类上无意义。
• 志贺菌致病力强，少量细菌进入人体即可 引起发病。是否发病，取决于细菌数量、 致病力（粘附、侵袭力、毒素）和人体的 抵抗力。 • 各种志贺菌都可以产生强烈的内毒素，是 引起全身毒血症的主要因素。志贺菌还可 产生外毒素（志贺毒素），具有神经毒、 细胞毒和肠毒性作用，能引起更严重的临 床表现如溶血性尿毒综合症等。
＋ －
－
＋ ＋
d 甘油 (＋) － (＋) 注：+阳性；-阴性；-/+多数阴性；+/-多数阳性；（+）迟缓阳性；d有不同生化型。 a 鲍氏13型为鸟氨酸阳性。 b福氏4型和6型常见甘露醇阴性变种。 c痢疾志贺1型和鲍氏13型为阳性。
附加生化实验
由于某些不活泼的大肠埃希氏菌 （anaerogenic E.coli）、A-D （Alkalescens-D isparbiotypes碱性-异型） 菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与 某种志贺氏菌分型血清发生凝集；因此前面 生化实验符合志贺氏菌属生化特性的培养物 还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、粘液 酸盐试验(36 ℃培养24 h～48 h)。志贺氏菌 属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D菌的生化特性 区别见表3
生化试验：可采用 API 20E或VITEK2
血清学鉴定：特异性 诊断血清鉴定到种。
志贺氏菌操作流程
修 改 的 内 容
增菌部分
志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5 μg/mL ）
原国标：GN ISO ：志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5 μg/mL ）
FDA：志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5 μg/mL 和3
生化反应 ß -半乳糖苷酶 尿素 赖氨酸脱羧酶 A群：痢疾志贺 氏菌 －c － － B群：福氏志贺 氏菌 － － － C群：鲍氏志贺 氏菌 －c － － D群：宋内氏志贺 氏菌 ＋ － －
鸟氨酸脱羧酶
水杨苷 七叶苷
－
－ －
－
－ －
－a
－ －
＋
－ －
靛基质
甘露醇 棉子糖
－/＋
－ －
(＋)
＋b ＋
－/＋
志贺氏菌的O抗原
• 人们原来的认识认为血清学试验是特异性 的，但是志贺氏菌的 O抗原和大肠埃希氏 菌属关系密切，有半数的菌型与大肠埃希 氏菌的某些O抗原完全相同。相同抗原菌属 间存在血清交叉凝集反应。因此，生化试 验对于属的鉴定是非常重要的。
志贺氏菌属与大肠埃希氏菌的O抗原关系
O抗原完全相同的：
2、志贺氏菌的分群与血清型
志贺氏菌分为四群： A群（痢疾志贺氏菌）：1~10型 B群（福氏志贺氏菌）：1~6型+X、Y两个变种， C群（鲍氏志贺氏菌 ）：1~15型 D群（宋内氏志贺氏菌） ：1个型
三、志贺氏菌检验
GB 4789.5-2012
1.以原国标为基础，保持与原标准的连续性
考虑基层单位方法的可操作性，对增菌步骤、培养条件
表面抗原（K抗原） 在新分离的某些菌株菌体表面含有此种抗原。 不耐热，加热100℃1小时即被破坏。具有此种 抗原的菌株，可阻止菌体抗原与相应免疫血清 发生凝集。
2.凝集反应
3.血清学分型（选做项目）
先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果呈现凝集，则 再用相应各群多价血清分别试验。先用B群福氏志贺氏菌 多价血清进行实验，如呈现凝集，再用其群和型因子血 清分别检查，福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗 原鉴别见表4。如果B群多价血清不凝集，则用D群宋内氏 志贺氏菌血清进行实验，如呈现凝集，则用其Ⅰ相和Ⅱ 相血清检查；如果B、D群多价血清都不凝集，则用A群痢 疾志贺氏菌多价血清及1～12各型因子血清检查，如果上 述三种多价血清都不凝集，可用C群鲍氏志贺氏菌多价检 查，并进一步用1～18各型因子血清检查。
（三）、生化反应
1、发酵葡萄糖，产酸不产气，除宋氏志贺 氏菌外，均不发酵乳糖。 2、不发酵侧金盏花醇、肌醇、水杨苷。 3、不产生H2S，不分解尿素，V-P试验阴性， 不能利用柠檬酸盐。 4、甲基红阳性。
（四）、抗原结构
1、抗原构成： O抗原： 群特异性抗原：A、B、C、D K抗原：除B群外，一般有K抗原