定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法

定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法

摘要

本发明提供一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。该方法灵敏度高，准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。

说明

定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及病毒滴度测定，具体地，涉及一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。背景技术

[0002]自从80年代初发现杆状病毒科核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polh)的强启动子特性后，Smith and Summer [Smith GE, MD Summers and MJ Fraser.Production ofhuman beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expressionvector.Mol Cell Biol.1983; 3 (12): 2156-2165]首次建立了杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System, BEVS)。杆状病毒表达系统已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，与大肠杆菌、酵母哺乳动物细胞表达系统相比，BEVS在以下四个方面具有特殊的研究价值:(I)作为超高效的真核基因表达系统，生产有用的目的蛋白；

[2]作为基因工程病毒杀虫剂，提高害虫防治效率；(3)研究杆状病毒基因组的结构和功能；(4)研究真核基因的表达调控机制。杆状病毒表达载体系统已成为研究各种原核蛋白和真核蛋白的非常有效和广泛使用的工具[李卫国，王厚伟，牟志美，石连辉.昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望.山东农业大学学报(自然科学版).2003，34(1): 134-138]。

[0003] 检测病毒滴度的方法有终点稀释法和空斑法。终点稀释法是常用检测病毒滴度的方法，具有简便、快速的特点。它是将病毒进行梯度系列稀释后感染细胞，通过检测50%组织细胞感染量(TCID5tl)来判定病毒滴度。空斑技术最早是由Dulbecco建立[DulbeccoR.-Production of plaques in monolayer tissues by using single particles ofanimal virus.Proc Nat Acad Scil952;

38 (8): 747-752], Hink 和Vial 后来把这项技术应用于杆状病毒的研究工作。空斑法是将适量病毒感染细胞后，病毒在感染的细胞内复制、增殖并释放出游离病毒粒子，这些游离病毒粒子由于受到琼脂糖固定培养基的限制，只能感染邻近的细胞。经过几个感染周期以后，这些被感染的细胞均死亡而不被中性红染色，周围的活细胞则被染成红色，于是在最初被病毒感染的细胞周围形成一个无色透明区域，即空斑。通过计数空斑的数量即可判定病毒滴度。

[0004] 对于野生型的昆虫杆状病毒而言，由于其可在感染细胞内形成肉眼可见的包涵体并在短期内将周围细胞崩解形成明显的空斑，用终点稀释法和空斑法均可以确定其滴度。但是对于重组昆虫病毒而言，由于其缺失了多角体蛋白基因，它不会像野生型的杆状病毒一样在感染细胞内形成肉眼可见的包涵体，因此不能用终点稀释法而只能用空斑法测定重组杆状病毒的滴度。

[0005] 检测重组昆虫病毒的最常用的方法是空斑法，但是由于空斑法操作繁琐，耗时较长(由于其缺失了多角体蛋白基因，其使受感染细胞发生崩解所需的时间也大大延长)，且技术较难掌握、误差较大。国外目前有两种检测重组昆虫病毒的方法:一种是通过免疫学方法检测重组杆状病毒感染的细胞表面标志蛋白gp64的表达来确定重组杆状病毒滴度[Dee, K.U, Shuler,

M.L.0ptimization of an assay for baculovirus titer anddesign of regimens for synchronous infection of insect cells.Biotechnol.Prog.1997; 13 (I):14-24]。该方法简便快速(48h内完成)，但价格昂贵；一种是直接将水母绿色突光蛋白(Green Flurescent Protein, GFP)作为报告基因构建重组杆状病毒,使重组杆状病毒筛选和滴度测定都变得极为简单[Takehiko Saito a, Takashi Dojima b, MasaruToriyama a, Enoch Y.Park The effect of cell cycle on GFPuv gene expression inthe baculovirus expression system.Journal of Biotechnology.2002;93(2):

121-129]。但该方法涉及到从上游的构建工作做起，工作量巨大。目前尚没有简便、快速地定量测定重组昆虫病毒滴度的方法。

[0006] 因此，本领域中需要一种低成本、简便、快速的方法来定量测定重组昆虫病毒滴度，以利于昆虫杆状表达系统的广泛研究及应用。

发明内容

[0007] 本发明涉及一种定量、简便和快速的方法，用于检测重组杆状病毒的滴度，具体地说，该方法通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量来定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。

[0008] 因此，本发明的目的是提供定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量来定量来实现。酸性磷酸酶法测定原理是活细胞内的酸性磷酸酶可以准确反映细胞数。在一定条件下，用去垢剂使细胞膜破裂释放出酸性磷酸酶，再与底物PNPP (对硝基苯磷酸酯)作用一段时间后，即可将其催化生成黄色的对硝基酚。这一呈色反映可以用酶标仪检测，所测的吸光度即可代表酸性磷酸酶活性，也间接反映了活细胞数。

[0009] 本发明提供了一种通过酸性磷酸酶法定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。包括下列步骤:

[0010] (a)将对数生长期的昆虫细胞重悬，用培养基进行适当稀释后接种昆虫细胞于96孔细胞培养板；

[0011] (b)将病毒滴度标准品与待检病毒液进行系列稀释，接种于昆虫细胞进行感染；

[0012] (C)加入底物液，显色一定时间后，酶标仪检测光吸收值；

[0013] (d)根据各系列稀释度病毒滴度标准品的光吸收值绘制标准曲线；