GSK和proteasome免疫荧光共定位详细步骤
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1.盖玻片用砂轮切割为1/4大小,洗衣液浸泡清洗后,放入酸缸中浸泡过夜,冲洗干净后烘干备用;
2.24孔板中滴少量培养液,浸在100%酒精中的爬片,在酒精灯上灼烧后放入孔中(注意此时需要晾比较长的时间,以免细胞被烫伤),24孔板接种细胞,浓度以60~80个/μl为标准,量为300μl/孔;
3.细胞一般培养两天后处理,选择较好的孔进行标记;
4.PBS漂洗2次,2×5min(300μl/孔);
5.100%甲醇-20℃预冷,-20℃固定细胞 8min(300μl/孔);
6.0.2%Triton-PBS,漂洗3×5min(300μl/孔),摇床上摇动;
7. 0.5%Triton-PBS,破膜8min (300μl/孔),摇床上摇动;
)封8. 0.2%Triton-PBS,漂洗3×5min(300μl/孔),5%BSA(含有0.02%NaN
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闭1h(300μl/孔),加一抗(100μl/孔)(GSK-3与proteasome都为1:500),室温下摇2h,4℃孵育两天;
9. 4℃拿出之后,常温摇30min,37℃孵育1h,以为一抗能够很好的结合,且回收一抗;
10. 0.2%Triton-PBS,漂洗3×10min(300μl/孔);
11.二抗(1:80,避光用5%BSA配制,100μl/孔)37℃孵育1h;
12. 0.2%Triton-PBS,避光漂洗3×10min(300μl/孔);
13.Hoechst(1μg/ml)复染15min(100μl/孔),0.2%Triton-PBS,避光漂洗3×10min(300μl/孔);
14.50%磷酸-甘油封片;
15.激光共聚焦显微技术观察;
16.避光4℃保存爬片,以备再次照相。