3.2制备和应用固定化酶

第三章酶的应用技术实践
3.2制备和应用固定化酶
探究目的：
1、说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理
2、尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。

探究预习：
固定化酶技术的发展也促进了固定化细胞技术的发展。

20世纪70年代后期出现了固定化细胞技术。

通过各种方法将细胞与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性，这一过程称为细胞固定化。

固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，由于保留了细胞内原有的多酶系统，这对多步催化的连续反应优势就更加明显。

细胞固定化的方法也有多种，主要是吸附法和包埋法两大类。

吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法。

动物细胞大多数具有附着特性，能够很好地附着在容器壁、微载体和中空纤维等载体上。

吸附法制备固定化植物细胞，是将植物细胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。

包埋法是指将细胞包埋在多孔载体的内部而制成固定化细胞的方法。

凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。

凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等。

海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞的操作简便，条件温和，对细胞无毒性。

通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。

用海藻酸钠凝胶制备的固定化细胞已用于多种酶的发酵生产与研究。

固定化细胞技术可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。

材料用具：干酵母，聚乙烯醇，海藻酸钠，无水CaCl2，蒸馏水，烧杯，玻璃棒，酒精灯，三角架，石棉网，注射器等。

探究反思：
固定化酵母菌技术有哪些优点？
探究示例：
请参照细胞固定化技术的相关基础知识，完成下列问题。

（1）细胞固定化技术一般采用包埋法固定化，采用该方法的原因是____________________________________________________________________。

（2）包埋法固定化是指_________________________________。

（3）包埋法固定化细胞常用的载体有____________________________________
______________________。

（答出三种即可）
（4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的优点是________________________________________________。

（5）制备固定化酵母细胞的步骤为：
①________________________________________________。

②_________________________________________________。

③___________________________________________。

④________________________________________________。

⑤__________________________________________________。

【解析】（1）固定化细胞的方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法，一般来说多采用包埋法固定化，因为个大的细胞难以被吸附或结合，且不易从包埋材料中漏出。

（2）（3）包埋法固定化即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。

常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠等。

（4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的成本更低．操作更容易。

（5）制备固定化酵母细胞的程序为：酵母细胞的活化→配制CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞。

【答案】（1）细胞个大，不易从包埋材料中漏出；（2）将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中；（3）明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等；（4）成本更低，操作更容易；（5）①酵母细胞的活化②配制CaCl2溶液③配制海藻酸钠溶液④海藻酸钠溶液与酵母细胞混合⑤酵母细胞的固定化。

【矫正反馈】
1．固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，其中适合细胞固定的方法是（）
A．包埋法B．物理吸附法C．化学结合法D．高温冷却法
2．与固定化酶相比，固定化细胞制备的特点是（）
A．成本高，但操作更容易B．成本低，但操作更复杂C．成本高，且操作更复杂D．成本低，且操作更容易3．固定化细胞技术在废水处理中有着重要作用，用于处理含氮、氨丰富的废水的固定化微生物通常是（）
①酵母菌②青霉菌③硝化菌④反硝化菌
A ．①②B．③④C．①③D．②④
4．酵母细胞的活化是指（）
A．让酵母细胞恢复运动状态B．让酵母细胞在缺水状态下休眠
C．让酵母细胞内酶活性加倍D．让处于休眠状态的酵母细胞重新恢复正常的生活状态5．下面为制备固定化酵母细胞的步骤，其正确的操作程序是（）
①海藻酸钠溶液与酵母细胞混合②配制海藻酸钠溶液③酵母细胞的活化④固定化酵母细胞⑤配制物质的量浓度为0.05 mol/L的CaCl2溶液
A．①②③④⑤B．③①②⑤④C．③⑤②①④D．③②⑤①④6．试分析下图中，哪一种与用海藻酸钠作载体制备的固定化酵母细胞相似（）
7．下列有关固定化酵母细胞制备步骤叙述，不恰当的是（）
A．应使干酵母与水混合并搅拌，以利于酵母菌活化
B．配制海藻酸钠溶液时要用小火间断加热的方法
C．向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，充分搅拌并混合均匀
D．将与酵母混匀的海藻酸钠溶液注入CaCl2溶液中，会观察到CaCl2溶液中有球形的凝胶珠形成8．用固定化酵母细胞发酵葡萄糖溶液时，为了能产生酒精，下列措施错误的是（）
A．向瓶内泵入氧气B．应将装置放于适宜的条件下进行
C．瓶内应富含葡萄糖等底物D．将瓶口密封，效果更好
9.下列属于固定化酶在利用时的特点的是（）
① ②
③ A ．有利于酶与产物分离 B ．制成的加酶洗衣服可以被反复利用 C ．能自由出入依附的载体 D ．能催化一系列的酶促反应
10．关于固定化酶技术说法正确的是 （ ） A ．固定化酶技术就是固定反应物，将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术 B ．固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应 C ．固定化酶中的酶无法重复利用
D ．固定化酶是将酶固定在一定空间内的技术
11．研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的。

如将从大肠杆菌得到的磷酸二酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，与用微生物降解相比，其作用不需要适宜的 （ ）
A ．温度
B ．pH
C ．水分
D ．营养 12.使用固定化细胞的优点是( )
A.能催化大分子物质的水解 B ．可催化一系列化学反应 C ．与反应物易接近 D ．有利于酶在细胞外发挥作用 13.酶的固定方法不包括( )
A.将酶吸附在固体表面 B ．将酶相互连接起来
C ．将酶包埋在细微网格里
D ． 将酶制成固体酶制剂，如加酶洗衣粉中的酶 14.下列关于酶制剂的叙述错误的是( )。

A ． 酶制剂是包含酶的制品
B ．包内酶和包外酶均可用于制成酶制品
C ．酶制品的生产包括酶的生产、提取、分离纯化和固定化等
D ．固定化细胞不属于酶制剂
15.如果反应物是大分子物质，采用那种方法催化受限制( )。

A ．直接使用酶 B ．使用化学方法结合的酶 C ．使用固定化细胞 D ．使用物理吸附法固定的酶 16.下列关于酶和细胞的固定叙述不正确的是( )。

A ． 酶分子很小，易采用包埋法
B ．酶分子很小，易采用化学结合或物理吸附法固定的酶
C ．细胞个大，难被吸附或结合
D ．细胞易采用包埋法固定 17. 关于固定化酶的叙述不正确的是 ( )。

A ． 既能与反应物接触，又能与产物分离
B ．固定在载体上的酶可被反复利用
C ．可催化一系列反应
D ．酶的活性和稳定性受到限制 18.固定化细胞对酶的活性影响最小，根本原因是( )。

A ．避免了细胞破碎、酶的提取纯化过程
B ．固定化细胞在多种酶促反应中连续发挥作用
C ．促化反应结束后，能被吸收和重复利用
D ．细胞结构保证了各种酶在细胞内化学反应中有效的发挥作用 19.关于酵母细胞活化的说法，不正确的是( )。

A ．酵母细胞活化就是由无氧呼吸变成有氧呼吸 B ．活化就是让处于休眠状态的细胞恢复生活状态
C ．酵母细胞活化所需要的时间较短
D ．酵母细胞活化后体积增大 20.下列关于酶的叙述中正确的是( )。

A ． 酶都提取于动植物细胞
B ．酶制剂能够重复利用
C ．果酒和果汁能够用酶制剂澄清
D ．酶固定后称为酶制剂 21.对配制海藻酸钠溶液的叙述不准确的是( )。

A ．加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环 B.海藻酸钠的浓度涉及固定化细胞的质量
C ．海藻酸钠的浓度过高，易形成凝胶珠
D ．海藻酸钠的浓度过低，形成凝胶珠内包埋细胞过少 22．目前，日用化工厂大量生产的酶制剂，其中的酶大都来自（ ） A ．化学合成 B 动物体内C 植物体内 D 微生物体内 【迁移应用】
1.下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是（ ） A ．固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显 B ．在固定化酶的应用中，要控制好pH 、温度和溶解氧
C ．利用固定化酶降解水体中的有机磷农药，需提供适宜的营养条件
D ．利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物
2．右图1表示制备固定化酵母细胞的有关操作，图2是利用固定化酵母细胞进行酒精发酵的示意图．下列叙述正确的是
A ．剐溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液-
B ．图1中X 溶液为CaCl 2溶液，其作用是使海藻酸钠形成凝胶珠
C ．图2发酵过程中搅拌的目的是为了使培养液与酵母菌充分接触
D ．图1中制备的凝胶珠用蒸馏水洗涤后再转移到图2装置中 3.下面是制备固定化酵母细胞的实验步骤，请回答：
酵母细胞的活化→配制CaCl 2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞。

（1）在________状态下，微生物处于休眠状态。

活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复________状态。

活化前应选择足够大的容器，因为酵母细胞活化时________。

（2）影响实验成败的关键步骤是________________。

（3）如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶 珠所包埋的酵母细胞数目________。

（4）观察形成凝胶珠的颜色和形状，如果颜色过浅，说明________________；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，说明___。

（5）固定化细胞技术一般采用包埋法固定化，原因是_________。

（6）该实验中CaCl 2溶液的作用是_________________________。

4．酵母菌是一种单细胞真菌，酿酒和做面包都需要酵母菌，根据所学知识回答：
（1）在探究“培养液中酵母菌种群的数量变化”的实验中，某学生的部分实验操作过程是这样的： ①从静置试管中吸取酵母菌培养液进行计数，记录数据； ②把酵母菌培养液放置在冰箱中；
③第七天再取样计算，记录数据，统计分析绘成曲线。

请纠正该同学实验操作中的错误：_____________________________________
____________________________________________________________________。

（2）下面的流程图示意是制备固定化酵母细胞的过程，请据图回答：
配制CaCl 2溶液→配制CaCl 2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞
①图中酵母菌活化就是____________________状态。

②影响此实验成败的关键步骤是________________，此步的操作应采用____________。

③观察形成的凝胶珠颜色和形状：如果颜色过浅，说明________________。

④本实验所用的固定化技术是________，而制备固定化酶则不宜用此方法，原因是____。

5.下图为固定化酶的反应柱示意图，请据图回答：
(1)请请在横线上填出各标号名称.①________②________ ③______。

(2) 与一般酶制剂相比，固定化酶的突出优点是_____________和_____, 固定化细胞的优点是___________________。

（3)③的作用是_______________。

（4）制作固定葡萄糖异构酶所用的方式有_________ 或____________。

（5）据图说出反应柱的作用原理。