生物活性测定法
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
目前对水质和环境毒性的检测广泛采用1979年Ｂｕｌｉｃｈ建 立的用2%ＮａＣｌ溶液复活冻干发光细菌体系，美国Ｂｉｃｒｏｂ ｉｃｓ公司推出了发光细菌急性毒性测定法和生物毒性检测仪。荷 兰利用假单胞发光菌测定水质中的毒性效应，并建立了有关的方法 标准。最近国际标准化组织发布了利用冻干的发光费氏弧菌检测水 质样品中抑制效应的生物测定方法。
目前所使用的农药按其化学结构大致可 分为以下几类：有机氯类，有机磷类，氨基 甲酸酯类，拟除虫菊酯类等。在我国农药中， 70%为有机磷农药，而在我国生产使用的有 机磷农药中，70％为剧毒、高毒类，而且较 多是禁止在蔬菜作物上使用的。
1 概述
1951年，Giang和Hall用有机磷和氨基甲酸酯农药 在体外抑制胆碱酯酶测农药含量。
淡水发光菌青海弧菌的发现解决了这一问题。
2 用家蝇检测蔬菜中的残留农药
60年代后期，台湾农业试验所采用生物测定方法进行农药残留 检验，其原理是释放高敏感性的家蝇于菜汁中，4～5ｈ后家蝇死亡 率在10%以下即为合格，该方法优点是过程简单无须复杂仪器检测， 缺点是检测时间较长，仅适用于田间未采收的蔬菜，另外该方法只 对部分杀虫剂有反应，无法分辨残留农药的种类，准确性较低。
未知含量样品：含量以100%计。
处理 标准品 样品
毒力回归方程
LC50
相关系数
Y=4.1241+1.2633x
4.94
0.9862
Y=3.4063+1.3995x
13.76
0.9849
样品中有效成分含量=4.94/13.76*100=35.91%
胆碱酯酶在农药残留快速检测中的应用 ——酶抑制分析测定法
EA K3
X
A+ E
有机磷杀虫剂杀虫作用机理
O
RO P OR'
RO
E + PX
有机磷类Baidu Nhomakorabea
K d PX .E K2
PX K3
P+ E
X
PX代表有机磷杀虫剂，X代表侧链部分例如对氧磷中的-O- NO2。E代表 AChE，Kd是解离常数(或者称亲和力常数)，K2是磷酰化反应速率常数有时写作 Kp，K3是脱磷酰基水解速率常数或者称酶致活常数。反应开始时有机磷酸酯先与 酶形成复合体(PX·E)，X分离后形成磷酰化酶(PE)，再经过脱磷酰基使AChE恢复。
2 生物活性测定方法 (１)杀虫剂
饲料混毒法： 叶片浸叶饲虫法 微量筛选法
（2）杀菌活性初筛方法 • 抑制孢子萌发法和抑制菌丝生长法。 • 盆栽试验。
3 结果统计 死亡率 抑制率 死亡率机率值
死亡率
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
0
5 浓度 10
15
20
剂量与死亡率的关系
原则：室内快速、简便繁殖，全年大量供应；主要农林有害 生物，具有重要经济意义，在分类上有一定代表性。 (一)昆虫和螨类：
我国经常采用的种类是： 鳞翅目：粘虫、棉铃虫、玉米螟、二化螟、小菜蛾 同翅目：褐飞虱、棉 蚜、豆 蚜、萝卜蚜、甘蓝蚜 储粮害虫：米 象、杂拟谷盗 螨类：朱砂叶螨 卫生害虫：家蝇、淡色库蚊
• 活体生物测定在农药残留中的应用
活体生物测定方法主要用发光细菌、敏感家蝇以及 大型水蚤等作为测试对象。
发光细菌已能用于有机磷农药的测定 敏感家绳可用于几乎所有有毒物的检测 大型水蚤除测定食品中添加剂、增效剂，还用于痕量 农药残留的测定。
1 用发光细菌检测农药残留
发光细菌体内的荧光 素在有氧时经荧光酶的作 用会产生荧光，但当受到 某些有毒化合物的作用时 发光会减弱，其减弱的程 度与有毒物的浓度呈一定 的线性关系，利用这一特 点对农药残留试样进行测 定。
AchE及其功能 Ach是一种神经传递介质 , AchE是一个水解酶，底物
是Ach。水解作用的反应式如下：
CH3COOCH2CH2N+(CH3)3 + H2O CH3COOH+HOCH2CH2N+(CH3)3
AchE的作用机制 AchE水解Ach的过程
E + AX
. K +1
K -1
E AX
K2
死亡率
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
5
10
15
20
25
30
浓度对数
浓度对数与死亡率之间的关系
probit
6.0 5.5 5.0 4.5 4.0
0.7959
1.0969
1.3979
dosage
1.6989
1.9999
浓度对数与机率值的关系
3 举例：Bt
标准品：设含量为100%。
1975年，Kramer和Gamson用靛酚乙酸酯类似物 测定有机磷化合物；
1968年，Mendoza利用薄层-酶抑制法测定有机磷 和氨基甲酸酯类农药，最小检出量达纳克水平。
20世纪80年代，酶源丰富。检测限0.1~10mg/l.
2 检测原理
（1） 有机磷和氨基甲酸酯杀虫 原理
突触部位的传导 突触结构简图(Hassall,1990)
• 生物活性测定在农药常量分析中的应用
1） 剂量：生物个体或生物单位体重所接受 的有效成分的量。
2） 反应：在一定剂量下有害生物所表现的 中毒现象。如死亡、拒食、抑菌等。
3）中浓度：LD50、LC50、EC50、ED50、 KT50
4）相对毒力指数：T=B/A*100
1 供测定的生物材料
明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)
最小检出浓度为3ｍｇ·Ｌ-1 已用于检测甲胺磷、敌敌畏等常用有机磷农 药。 特点：快速、简便、灵敏、价廉，适合于现 场分析 缺点：农药浓度与发光强度的线性关系不够 准确，只能用于半定量测定。
长期以来使用的发光细菌是海洋发光细菌，但该方法有严重不 足，即必须在检测的样品中加入3%的ＮａＣｌ的细菌才能正常发 光。
植物病原菌 我国经常采用的植物病原菌是： 稻瘟病菌 、水稻纹枯病菌、小麦条绣病菌、甘薯黑疤病菌、 马铃薯晚疫病菌、番茄早疫病菌、柑桔青霉病菌、苹果黑星病 菌、棉花炭疽病菌、黄瓜霜霉病菌、花生褐斑病菌、、番茄灰 霉病菌
杂草 我国常用的种类是: 窄叶杂草：野燕麦、稗、看麦娘 阔叶杂草：苋、荠菜、播娘蒿、藜Chenopodium album L.
3 用大型水蚤为试验材料监测蔬菜中农药的残留
水蚤
原理是将蔬菜汁稀释,每个剂量10个水蚤，测定24ｈ、 28ｈ、96ｈ的实验结果，以实验水蚤的心脏停止跳动作为 最终死亡指标，测定半数致死浓度。大型水蚤测试技术完 全适用于蔬菜中的农药残留测定, 具有快速、灵敏、简便、 经济等特点，但该方法也无法分辨残留农药的种类。
目前所使用的农药按其化学结构大致可 分为以下几类：有机氯类，有机磷类，氨基 甲酸酯类，拟除虫菊酯类等。在我国农药中， 70%为有机磷农药，而在我国生产使用的有 机磷农药中，70％为剧毒、高毒类，而且较 多是禁止在蔬菜作物上使用的。
1 概述
1951年，Giang和Hall用有机磷和氨基甲酸酯农药 在体外抑制胆碱酯酶测农药含量。
淡水发光菌青海弧菌的发现解决了这一问题。
2 用家蝇检测蔬菜中的残留农药
60年代后期，台湾农业试验所采用生物测定方法进行农药残留 检验，其原理是释放高敏感性的家蝇于菜汁中，4～5ｈ后家蝇死亡 率在10%以下即为合格，该方法优点是过程简单无须复杂仪器检测， 缺点是检测时间较长，仅适用于田间未采收的蔬菜，另外该方法只 对部分杀虫剂有反应，无法分辨残留农药的种类，准确性较低。
未知含量样品：含量以100%计。
处理 标准品 样品
毒力回归方程
LC50
相关系数
Y=4.1241+1.2633x
4.94
0.9862
Y=3.4063+1.3995x
13.76
0.9849
样品中有效成分含量=4.94/13.76*100=35.91%
胆碱酯酶在农药残留快速检测中的应用 ——酶抑制分析测定法
EA K3
X
A+ E
有机磷杀虫剂杀虫作用机理
O
RO P OR'
RO
E + PX
有机磷类Baidu Nhomakorabea
K d PX .E K2
PX K3
P+ E
X
PX代表有机磷杀虫剂，X代表侧链部分例如对氧磷中的-O- NO2。E代表 AChE，Kd是解离常数(或者称亲和力常数)，K2是磷酰化反应速率常数有时写作 Kp，K3是脱磷酰基水解速率常数或者称酶致活常数。反应开始时有机磷酸酯先与 酶形成复合体(PX·E)，X分离后形成磷酰化酶(PE)，再经过脱磷酰基使AChE恢复。
2 生物活性测定方法 (１)杀虫剂
饲料混毒法： 叶片浸叶饲虫法 微量筛选法
（2）杀菌活性初筛方法 • 抑制孢子萌发法和抑制菌丝生长法。 • 盆栽试验。
3 结果统计 死亡率 抑制率 死亡率机率值
死亡率
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
0
5 浓度 10
15
20
剂量与死亡率的关系
原则：室内快速、简便繁殖，全年大量供应；主要农林有害 生物，具有重要经济意义，在分类上有一定代表性。 (一)昆虫和螨类：
我国经常采用的种类是： 鳞翅目：粘虫、棉铃虫、玉米螟、二化螟、小菜蛾 同翅目：褐飞虱、棉 蚜、豆 蚜、萝卜蚜、甘蓝蚜 储粮害虫：米 象、杂拟谷盗 螨类：朱砂叶螨 卫生害虫：家蝇、淡色库蚊
• 活体生物测定在农药残留中的应用
活体生物测定方法主要用发光细菌、敏感家蝇以及 大型水蚤等作为测试对象。
发光细菌已能用于有机磷农药的测定 敏感家绳可用于几乎所有有毒物的检测 大型水蚤除测定食品中添加剂、增效剂，还用于痕量 农药残留的测定。
1 用发光细菌检测农药残留
发光细菌体内的荧光 素在有氧时经荧光酶的作 用会产生荧光，但当受到 某些有毒化合物的作用时 发光会减弱，其减弱的程 度与有毒物的浓度呈一定 的线性关系，利用这一特 点对农药残留试样进行测 定。
AchE及其功能 Ach是一种神经传递介质 , AchE是一个水解酶，底物
是Ach。水解作用的反应式如下：
CH3COOCH2CH2N+(CH3)3 + H2O CH3COOH+HOCH2CH2N+(CH3)3
AchE的作用机制 AchE水解Ach的过程
E + AX
. K +1
K -1
E AX
K2
死亡率
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
5
10
15
20
25
30
浓度对数
浓度对数与死亡率之间的关系
probit
6.0 5.5 5.0 4.5 4.0
0.7959
1.0969
1.3979
dosage
1.6989
1.9999
浓度对数与机率值的关系
3 举例：Bt
标准品：设含量为100%。
1975年，Kramer和Gamson用靛酚乙酸酯类似物 测定有机磷化合物；
1968年，Mendoza利用薄层-酶抑制法测定有机磷 和氨基甲酸酯类农药，最小检出量达纳克水平。
20世纪80年代，酶源丰富。检测限0.1~10mg/l.
2 检测原理
（1） 有机磷和氨基甲酸酯杀虫 原理
突触部位的传导 突触结构简图(Hassall,1990)
• 生物活性测定在农药常量分析中的应用
1） 剂量：生物个体或生物单位体重所接受 的有效成分的量。
2） 反应：在一定剂量下有害生物所表现的 中毒现象。如死亡、拒食、抑菌等。
3）中浓度：LD50、LC50、EC50、ED50、 KT50
4）相对毒力指数：T=B/A*100
1 供测定的生物材料
明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)
最小检出浓度为3ｍｇ·Ｌ-1 已用于检测甲胺磷、敌敌畏等常用有机磷农 药。 特点：快速、简便、灵敏、价廉，适合于现 场分析 缺点：农药浓度与发光强度的线性关系不够 准确，只能用于半定量测定。
长期以来使用的发光细菌是海洋发光细菌，但该方法有严重不 足，即必须在检测的样品中加入3%的ＮａＣｌ的细菌才能正常发 光。
植物病原菌 我国经常采用的植物病原菌是： 稻瘟病菌 、水稻纹枯病菌、小麦条绣病菌、甘薯黑疤病菌、 马铃薯晚疫病菌、番茄早疫病菌、柑桔青霉病菌、苹果黑星病 菌、棉花炭疽病菌、黄瓜霜霉病菌、花生褐斑病菌、、番茄灰 霉病菌
杂草 我国常用的种类是: 窄叶杂草：野燕麦、稗、看麦娘 阔叶杂草：苋、荠菜、播娘蒿、藜Chenopodium album L.
3 用大型水蚤为试验材料监测蔬菜中农药的残留
水蚤
原理是将蔬菜汁稀释,每个剂量10个水蚤，测定24ｈ、 28ｈ、96ｈ的实验结果，以实验水蚤的心脏停止跳动作为 最终死亡指标，测定半数致死浓度。大型水蚤测试技术完 全适用于蔬菜中的农药残留测定, 具有快速、灵敏、简便、 经济等特点，但该方法也无法分辨残留农药的种类。