图位克隆的基本原理和方法-PPT课件

AH HAA
67 AA AA AA BH BB
8 9 10 AA B AA A AA A HA A HB A
基因和表型Hale Waihona Puke Baidu对应！
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开发新的标记：
新的SSR标记： http://redb.ncpgr.cn/modules/redbtools/ssrscan.php， 运行SSRScan就会得到该段序列的简单重复序列。
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作图群体
将纯合突变体与ZS97进行杂交，对杂交的种子进行基 因型鉴定，找到杂合型种子（即种子能够发生分离）， 将杂合F1代种子种下去后就能得到F2代群体。
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r/r
R/R
P1 纯合突变体
×
P2 ZS97
F1
R/r
F2
R/R
R/r
r/r
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primary mapping method
Bulked Segregment Analysis：群组分离分析法。原理是将分 离群体(F2、BC1等)中的个体依据研究的目标性状(如抗病、 感病)分成两组，每一组取样8-15份，在每一组群体中将各个 体DNA等量（等浓度等体积）混合，形成两个DNA池(如抗 病池和感病池)。同时需要构建两个亲本（ZH11/ZS97）的 BSA池。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池间 理论上就应主要在目标基因区段存在差异。
二. 筛选交换单株
三. 开发新的分子标记
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r/r
R/R
P1 纯合突变体
×
P2 ZS97
F1
R/r
F2
R/R
R/r
正常表型
r/r 突变表型
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ZH11：“A” ZS97：“B”
交换有两种带型：H和B
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单株 1 2 3 4 5
M1
H AABH
M2
H AABA
M3
A AAAA
M4
A HAAA
M5
找到紧密连锁的分子标记之后我们就要进行一个“阳性”检测： 即检测这个找到的分子标记是不是真正的与目标性状连锁。 我们对F2代群体中随机选取一个200左右的小群体，将找到的分 子标记分别扩增这些样，看表型与基因型是否对应。 同时我们可以用这个小群体进行一个初步的基因定位。
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一. 表型观察
Fine mapping
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精细定位
• 扩大群体，进行精细定位
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Complementation test
找到候选基因后可对候选基因进行分析以排除非目标基因， 可以通过比较扩增，测序，表达量检测及目标性状相关的 生化和生理途径等方法来排除。当然最后要说明问题的话 就是构建互补载体做一个互补验证。
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InDel/Caps标记：将要开发标记的日本晴区段序列与93-11做一个 blast，选取插入或者缺失比较大的位点设计引物。 SNPS标记:可以通过测序找到在ZH11/ZS97间存在单碱基差异的位点， 或者找谢老师咨询。
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Candidate gene
将最后精细定位区段在http://rice.plantbiology.msu.edu/cgibin/gbrowse/rice/ 中输入定位区间的物理位置，即可显示出候选基因。
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将构建的BSA池分别用本室的255对在亲本ZH11/ZS97间存在多态性的SSR标 记进行PCR扩增，经过跑PAGE胶找到与目标性状紧密连锁的标记。
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HL15(M )
HL15(W ) ZS97
ZH11
HL15(M ) HL15(W ) ZS97
ZH11
HL15(M) HL15(W) HY5(M) HY5(W) HY3(M) HY3(W) HY2(M) HY2(W) HY1(M) HY1(W) ZS97 ZH11
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图位克隆的步骤：
Primary mapping Fine mapping Candidate gene
Complementation test Functional analysis
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Primary mapping
primary mapping method and Mapping population
图位克隆的基本原 理和方法
何宗顺 2011.12.7
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图位克隆的基本原理
其基本的原理是： 功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，通过找到 与目标性状紧密连锁的分子标记，在利用分子标记技术对 目的基因精细定位的基础上，由于水稻全基因组序列的发 布，我们可以得到已定位区段的候选基因，通过对候选基 因进行分析，确定目标基因，最后经遗传转化试验证实目 的基因功能。